比濁法快速測定硫酸多黏菌素E效價(jià)

【摘要】  研究比濁法測定硫酸多黏菌素E效價(jià)的影響因素和規律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速測定方法，檢測時(shí)間由杯碟法的20h縮短到4h。當硫酸多黏菌素E的效價(jià)為30～100u/ml時(shí)，檢測菌液接種濃度為5%，培養時(shí)間為4h，吸光度對數值與抗生素效價(jià)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。本法重現性好，相對誤差小于5%。

【關(guān)鍵詞】  硫酸多黏菌素E 比濁法 效價(jià)

    Fast determination of the potency of polymyxin E by turbidimetry assay

    ABSTRACT  A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency was developed by studying on the influencing factors. Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determination time from 20 hours to 4 hours. There was a linear relationship between the potency of polymyxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30～100u/ml and inoculating concentration was 5%, with 4�瞙our culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less than 5%.

    KEY WORDS  Polymyxin E;  Turbidimetry assay;  Potency

     多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢桿菌抗敵素變株(Bacillus polymyxin var.colisti�瞡us)經(jīng)發(fā)酵培養生產(chǎn)的一種環(huán)狀多肽類(lèi)抗生素，它對革蘭陰性桿菌有強烈的抑菌作用［1］。由于多黏菌素E具有高效、低毒、殘留少的特性，將其硫酸鹽制成獸藥用于防治由大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)菌等革蘭陰性菌［2］引起的肉雞、豬、牛等畜禽的腸道疾病。目前采用杯碟法［3，4］測定其生物效價(jià)。杯碟法操作步驟復雜，耗時(shí)長(cháng)，測定時(shí)間需要大約20h，不能快速反饋工業(yè)生產(chǎn)中各個(gè)階段產(chǎn)品生物活性，必須開(kāi)發(fā)一種快速測定硫酸多黏菌素E效價(jià)的方法。比濁法是抗生素效價(jià)微生物檢定的方法之一［5～8］，其原理是將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的液體培養基內，混勻后，經(jīng)短期培養，測量培養物的吸光度，在一定線(xiàn)性范圍內細菌培養物吸光度的對數值logA與抗生素的濃度成正比，比濁法具有檢測快速的特點(diǎn)。本文深入研究了比濁法測定硫酸多黏菌素E效價(jià)的影響因素和規律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速檢測方法。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    (1)檢定菌  大腸埃希菌(CMCC(B)44102)購自微生物菌種保藏中心。

    (2)硫酸黏桿菌E素(硫酸多黏菌素E)標準品  中國獸醫藥品監查所提供，批號K02700902，效價(jià)19536u/mg。

    (3)主要儀器  752紫外分光光度計；恒溫水浴振蕩器；牛津杯(不銹鋼，高100mm，外徑8.0mm，內徑6.0mm)；PHS��3C精密pH計。

    1.2  方法

    (1)檢定培養基的制備  稱(chēng)取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氫二鉀3.3g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸餾水至1000ml加熱混勻，調節pH值為7.2，過(guò)濾，115℃滅菌30min。

    (2)檢測菌液的制備  取大腸埃希菌的瓊脂斜面培養物一支，加0.9%滅菌生理鹽水1ml洗下菌苔轉入茄瓶，37℃培養18～22h，用0.9%滅菌生理鹽水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度計上波長(cháng)為600nm處用0.9%滅菌生理鹽水調節菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接種量接種至檢定培養基作為檢測菌液。

    (3)硫酸多黏菌素E標準溶液的配制  精確稱(chēng)取硫酸多黏菌素E標準品，用pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋到600u/ml，再用水稀釋成濃度分別為30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種濃度的標準溶液。

    (4)比濁法吸光度測定  精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以200r/min轉速37℃振蕩培養一定時(shí)間，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長(cháng)處［9］分別測定吸光度。

    (5)比濁法樣品檢測  將樣品稀釋到適當濃度后，按實(shí)驗1.2.(4)中有關(guān)步驟操作測定吸光度，在吸光度對數�残�價(jià)標準曲線(xiàn)上查對應的效價(jià)，乘以稀釋倍數，即得到樣品的效價(jià)。

    2  結果與討論

    2.1  檢測條件的選擇

    (1)大腸埃希菌生長(cháng)曲線(xiàn)的測定  將大腸埃希菌菌液分別以2.5%、5.0%和10%的接種量接入檢定培養基，37℃條件下以200r/min振蕩培養，在600nm處每小時(shí)檢測一次培養物的吸光度，結果如Fig.1所示。大腸埃希菌在自然狀態(tài)下生長(cháng)時(shí)延遲期一般為1h左右，這一時(shí)期菌體生長(cháng)緩慢，菌量基本上維持在最低水平；然后進(jìn)入指數期，這一時(shí)期大約持續7～8h，這一時(shí)期菌體生長(cháng)速率常數最大，生長(cháng)最迅速；9h以后進(jìn)入穩定期，菌體總量保持不變。當菌體生長(cháng)時(shí)間在2～4h，吸光度值達到0.4～1.0，處于最佳檢測時(shí)期。

    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%

    Fig.1    Cell growth curve of E.coli    (2)檢測菌液接種濃度的選擇  將接種濃度分別為2.5%、5.0%和10%的檢測菌液按實(shí)驗1.2.(4)培養2h，繪制吸光度�残�價(jià)曲線(xiàn)(Fig.2)。 由Fig.2可見(jiàn)，不同接種濃度的檢測菌液對培養物的吸光度影響較大。當檢測菌液接種濃度為2.5%時(shí)，由于初始接種量少，少量抗生素的存在能夠完全抑制菌體的生長(cháng)，菌體幾乎不能生長(cháng)；當檢測菌液接種濃度為10%時(shí)，菌體生長(cháng)很快，抗生素難以抑制菌體生長(cháng)，不同濃度抗生素對菌體生長(cháng)的抑制程度不明顯；當檢測菌液接種濃度為5%時(shí)，不同濃度抗生素對菌體生長(cháng)的抑制程度區別明顯，靈敏度高，因此5%接種濃度的檢測菌液適合本法測定硫酸多黏菌素E效價(jià)。

    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%

    Fig.2    Effect of different innoculating concentration

    on absorbency

    (3)培養時(shí)間的選擇  接種濃度5.0%的檢測菌液，按實(shí)驗1.2.(4)分別培養2、3和4h，繪制吸光度�残�價(jià)曲線(xiàn)(Fig.3)。由Fig.3可見(jiàn)，在實(shí)驗菌接種量固定在5%的條件下，增加培養時(shí)間，靈敏度提高顯著(zhù)。培養時(shí)間為2h，吸光度�残�價(jià)曲線(xiàn)比較平坦，靈敏度低，當培養時(shí)間增加為4h，不同濃度抗生素對菌體生長(cháng)的抑制程度區別明顯，靈敏度高，因此選擇4h作為培養時(shí)間用于檢測。

2.2  標準曲線(xiàn)的確立

    精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種硫酸多黏菌素E標準溶液各1ml，加9ml接種濃度為5%的檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以轉速200r/min 37℃培養4h，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長(cháng)處分別測定吸光度，以硫酸多黏菌素E濃度為橫坐標，吸光度對數值為縱坐標，繪制標準曲線(xiàn)(Fig.4)。

    將吸光度對數值對相應濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程：

    lgA=-0.01039C+0.1837  r=0.9953

    可見(jiàn)硫酸多黏菌素E的濃度在30～100u/ml的范圍內與吸光度對數值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

    2.3  重現性測定

    用比濁法對3個(gè)不同規格的硫酸多黏菌素E樣品進(jìn)行重現性試驗，檢測4次結果見(jiàn)Tab.1，相對標準偏差在3%以?xún)�，重現性較好。

    2.4  正確性測定

    以杯碟法［10］測定效價(jià)數據為標準，得出本方法的準確度(Tab.2)；比濁法測定的相對誤差在5%以?xún)�，符合藥典規定要求，提示比濁法能夠準確測定硫酸多黏菌素E效價(jià)。

    3  結論

    (1)比濁法能夠快速、準確地測定硫酸多黏菌素E效價(jià)，檢測時(shí)間由杯碟法的20h縮短到4h，方法重現性好，相對誤差小于5%。

    (2)比濁法進(jìn)行硫酸多黏菌素E效價(jià)測定時(shí)應注意培養基的質(zhì)量以及檢測儀器等。培養基配置后應過(guò)濾后再滅菌，以免培養基中形成沉淀影響測量。試管應選同一批、同一型號，管壁均勻一致，試管潔凈無(wú)污染，以免影響測量結果。培養結束后立即冷卻，測定前應搖勻。

 

 作者：佟斌 吳兆亮 殷昊 趙艷麗 《中國抗生素雜志》

【參考文獻】

  ［1］ Starkey D D, Antoinette I, Ralph J W. Paradoxical synergism and antagonism between serum and antibacterial activity of colistin ［J］. J Infect Dis,1971,23(4):392

［2］ Jian L, Roger L N, Robert W M, et al. Evaluation of colistin as an agent against multi�瞨esistant Gram�瞡egative bacteria ［J］. Int J Antimicrob Agents,2005,(25):11

［3］ 吳佩玲. 改進(jìn)硫酸粘桿菌素含量測定方法的介紹［J］. 中國獸藥雜志，1990，3：22

［4］ 張純平，肖希龍. 硫酸粘桿菌素微生物檢定法的改進(jìn)［J］. 中國獸藥雜志，2002，36(4)：33

［5］ 楊亞莉, 胡昌勤. 中國藥典2005年版微生物檢定法的增修訂情況及要點(diǎn)［J］. 中國抗生素雜志，2005，30(12)：707

［6］ The European Pharmacopoeia Commission. The European Pharmacopoeia［S］. 5ed.Brussels: Council of Europe,2002

［7］ 張治錟. 抗生素藥品檢驗［M］. 北京：人民衛生出版社,1987：80

［8］ 朱會(huì )琴，逢渙歡，胡昌勤，等. 濁度法測定兩性霉素B及其脂質(zhì)體的效價(jià)［J］. 中國抗生素雜志，2005，30(12)：752

［9］ 沈萍，范秀容，李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(第三版)［M］. 北京：高等教育出版社，1999：97

［10］ 國家藥典委員會(huì ). 中華人民共和國藥典2005年版(二部)［S］. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄XIA