耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的研究

銅綠假單胞菌是一種臨床上常見(jiàn)的醫院內的條件致病菌，本研究通過(guò)對耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥分析，了解耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥機制，以利于臨床合理用藥�，F報道如下。

　　1.1  資料 

　　(1)菌株：收集自200５年1至12月本院ＶＩＴＥＫ－３２儀檢出的耐亞胺培南銅綠假單胞菌２２株。銅綠假單胞菌標準菌株ATCC 27853一株；(2)藥敏紙片：頭孢塞肟、頭孢曲松、頭孢他定、亞胺培南；(3)OprD2基因擴增試劑盒：裂解液A、裂解液B、反應液、耐熱酶、陽(yáng)性模板；(4)其他：9.8%（EDTA·K2+NA2HPO4），無(wú)菌生理鹽水，M-H平板，血平板等。

　　1.2  方法 

　　(1)紙片擴散法初篩：將新分離的純菌種配成0.5McFarland密涂于M-H瓊脂平板（Φ70mm）10min后于平板中央貼上EDTA紙片，紙片分2組：1組為頭孢塞肟、頭孢曲松，在距離EDTA紙片1cm處對稱(chēng)分別貼上頭孢塞肟和頭孢曲松。另1組為頭孢他定、亞胺培南，在距離EDTA紙片1cm處分別貼上頭孢他定、亞胺培南。35℃培養24h后觀(guān)察結果。結果判斷：①出現協(xié)同現象可能為產(chǎn)金屬酶；②不出現協(xié)同現象可能為膜通透障礙或既產(chǎn)金屬酶又有膜通透障礙；(2)粗提酶（凍融裂解法）將新分離的純菌種配成0.5McFarland,取50μl于肉湯中35℃培養增菌24h后取1ml于離心管（1.5ml）中，-80℃反復凍融數次，培養無(wú)菌生長(cháng)后于4℃離心機，以10000轉/min離心25min，取上清液后-80℃保存待用；(3)改良三維試驗［１］： 將銅綠假單胞菌標準株ATCC27853配成0.5McFarland密涂于M-H平板（Φ90mm）待干后于平板中央貼上亞胺培南紙片，距紙片2mm處分別成180°打2個(gè)寬1mm、長(cháng)2cm的槽（標明①②），在①加酶粗提液20μl、②加酶粗提液+EDTA（9：1）35℃培養24h后判斷結果    

　　結果判斷：①有擴大生長(cháng)、②抑菌圈光滑完整則為產(chǎn)金屬酶；②有擴大生長(cháng)、①抑菌圈光滑完整則為產(chǎn)金屬酶以外的碳青酶烯酶；①、②抑菌圈均光滑完整則為膜通透性障礙；(4)PCR：菌株處理：挑取少許新分離的純菌種置入內含無(wú)菌生理鹽水（100μl）的離心管（0.5ml），離心15000rmp5min，棄上清液，加裂解液A 50μl，裂解液B 2μl，混勻后置入55℃保溫1h后置入95℃保溫5min ，離心10000rpm30 min，上清液即為擴增的模板液。反應體系配制：將反應液管內液體全部移入耐熱酶管，以15μl至20小管，實(shí)驗時(shí)將5μl膜板液移入反應體系中并加蓋石蠟油2滴即可。熱循環(huán)參數：95℃預變性2min然后93℃30min→55℃30min→72℃60min共循環(huán)35周期，最后一個(gè)周期72℃延長(cháng)至2min。結果觀(guān)察：取擴增產(chǎn)物10μl與2μl溴酚蘭指示劑混勻，點(diǎn)樣于2%瓊脂糖凝膠中，以100v電壓電泳20～30min，出現與陽(yáng)性膜板分子量相同的條帶（193bp）即為陽(yáng)性。

　　2.1  表型初篩結果 

　�。玻仓赉~綠假單胞菌中有１０株產(chǎn)生協(xié)同現象占4５．4%。  

　　2.2  改良三維試驗結果 

　�。玻仓赉~綠假單胞菌中有５株產(chǎn)金屬酶占22.７%。

　　2.3PCR結果  　　

　�。玻仓赉~綠假單胞菌中有４株為OprD缺失，即由膜通透障礙引起占1８.８%。 

　　2.4  22株銅綠假單胞菌抗菌藥物敏感性統計見(jiàn)表1。表1  22株銅綠假單胞菌的抗菌藥物敏感性統計 （略）

亞胺培南是一種新型的β-內酰胺類(lèi)抗生素，屬碳青酶烯類(lèi)，具有較好的抗菌活性，且對β-內酰胺酶穩定［２］，是治療假單胞菌感染活性最強的藥物之一，但隨著(zhù)臨床的廣泛使用，耐亞胺培南菌株開(kāi)始出現并日益增多，嚴重限制了亞胺培南的應用。銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥常不是由單一因素造成的，目前認為造成本菌耐亞胺培南的已知主要原因有4種，即(1)產(chǎn)生β內酰胺酶：據Pai 等報道部分菌株可能產(chǎn)β-類(lèi)酰胺酶［３］，本實(shí)驗中由于產(chǎn)金屬酶而耐藥的菌株為5株(22.7%)；(2)膜通透性障礙：即其外層細胞壁的外膜蛋白D2是碳青霉烯類(lèi)抗生素進(jìn)入的通道，失去特異性外膜蛋白D2導致藥物不能進(jìn)入細菌體內，Statake等［４］認為患者接受過(guò)其他內酰胺類(lèi)藥物抗感染治療后，會(huì )誘導銅綠假單胞菌失去其膜蛋白通道oprD2，從而對亞胺培南形成耐藥，本實(shí)驗OprD2基因擴增結果顯示：22株銅綠假單胞菌中有4株菌株表現為OprD2缺失(18.8%)；(3)細胞外膜主動(dòng)外排系統的表達；(4)青霉素結合蛋白的改變：本實(shí)驗未涉及3、４點(diǎn)，在此也作詳敘述。以上可見(jiàn)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥機制的復雜性。因此，在治療銅綠假單胞菌引起的疾病時(shí)，建議在臨床上選擇抗菌藥物時(shí)以細菌培養為前提，藥敏實(shí)驗結果為依據，合理選擇敏感的藥物治療方案［５］，防止耐藥菌株的出現和傳播。

 

作者：李蘇婭 史煜波《浙江臨床醫學(xué)》

  　　1 陳東科，張志敏，張秀珍.三維法檢測β-內酰胺酶的影響因素探討方法的改進(jìn).中華檢驗醫學(xué)雜志，2003，26（10）：600～604.

　　2 朱琴，彭少華. 銅綠假單胞菌對碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機制.醫學(xué)新雜志，2002，12（4）：206～207.

　　3 Pai H , Kim J . Carbapenem resistance mechanis in pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Ａgents Ｃhemother ,2001,45:480～484.

　　4 Statake S, Yoneyama H ， Nakae T. Role of Omp D2 and chromosomal β�瞝actamase in carbopenem resistance in clinical isolates of pseudomones aeruoginosa. J Antimicrob Chemother ,1991,28:199～207.

5 葉曉光，王若倫. 銅綠假單胞菌耐藥性動(dòng)態(tài)變化特征及分析. 中華醫院感染學(xué)雜志，2004，14（6）：607～609.