大腸埃希菌耐藥性質(zhì)粒的提取及鑒定

【摘要】  目的 檢測大腸埃希菌對9種抗生素的耐藥性，探討大腸埃希菌耐藥的分子機制。方法采用平皿二倍稀釋法測定40株臨床分離的大腸埃希菌對抗生素的敏感性，同時(shí)用堿裂解法對耐藥菌株進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，將得到的質(zhì)粒轉化至受體菌JM109進(jìn)行質(zhì)粒耐藥性的鑒定。結果 40株大腸埃希菌對頭孢菌素等9種抗生素呈現出不同程度的耐藥現象。對氨芐西林和青霉素的耐藥性分別達到了87.5%和97.5%。從兩株耐藥大腸埃希菌中提取出質(zhì)粒，對其中一株進(jìn)行轉化鑒定，確定為耐藥質(zhì)粒，大小約為3.0kb。結論 臨床分離大腸埃希菌對多種抗生素表現出較高的耐藥性，而耐藥性質(zhì)粒的存在是細菌產(chǎn)生耐藥性的機制之一。

【關(guān)鍵詞】  大腸埃希菌；耐藥性；質(zhì)粒

    Extraction and identification of resistance plasmids in Escherichia coli

    【Abstract】  Objective  To detect the antibiotic susceptibility of E.coli strains to 9 antibacterial agents and to explore the molecular mechanism of resistance in E.coli.Methods  Antibiotic susceptibility of 40 strains of E.coli isolates were carried out by the agar dilution method.Plasmid DNA were extracted by alkaline lysis and R plasmid was identified by transformation.Results  40 strains of E.coli isolates exhibit resistance to 9 different antibiotics in some extent.The resistant rates to ampicillin and penicillin were 87.5% and 97.5%,respectively.Two plasmids of 3.0kb were isolated from two strains of E.coli.Conclusion  40 strains of E.coli isolates exhibit resistance to 9 antibiotics and molecular mechanisms of resistance in some strains of E.coli were mediated by R plasmid in part.

    【Key words】  Escherichia coli;drug resistance;plasmid

    大腸埃希菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常見(jiàn)條件致病菌［1］。隨著(zhù)第三代頭孢菌素的廣泛應用，此類(lèi)細菌表現出較嚴重的多重耐藥性，并常導致嚴重的院內感染，使得抗菌感染治療變得棘手。近年來(lái)大量文獻證實(shí)了產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是造成大腸埃希菌對第三代頭孢菌素的耐藥性重要原因［2］。質(zhì)粒介導的耐藥性是細菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一，攜帶多種耐藥表型的R質(zhì)粒常在某一地區流行并在一定條件下可在細菌中傳播。因此，對耐藥機制的研究是預防和控制細菌耐藥的戰略措施［3］。本研究對40株臨床分離的大腸埃希菌進(jìn)行了耐藥性的測定，并對耐藥菌株進(jìn)行了質(zhì)粒的提取及鑒定。

　　1  材料與方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌株來(lái)源  40株大腸埃希菌由臨床分離并進(jìn)行鑒定。大腸桿菌JM109由本實(shí)驗室保存。

    1.1.2  藥品和試劑  氨芐西林，青霉素（購自華北制藥股份有限公司）；頭孢拉定，頭孢噻肟鈉，頭孢哌酮鈉，頭孢曲松鈉（購自上海先鋒藥業(yè)有限公司）；紅霉素（購自大連美羅大藥廠(chǎng)）；阿奇霉素（購自杭州澳亞生物技術(shù)有限公司）；鹽酸環(huán)丙沙星（購自貴州科倫藥業(yè)有限公司）；酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）（購自BioFlux公司）；普通營(yíng)養瓊脂培養基（購自杭州天和微生物試劑有限公司）。質(zhì)粒提取液：溶液Ⅰ：含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L Tris·C1（pH8.0），10mmol/L EDTA；溶液Ⅱ：含0.2mol/L NaOH和1%SDS（現用現配）；溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，HAc 11.5ml，水28.5ml配置成100ml的溶液。

    1.2  方法

    1.2.1  藥敏試驗  采用常規瓊脂二倍稀釋法檢測40株大腸埃希菌對9種抗生素的最低抑菌濃度（MIC）以及MIC50和MIC90。

    1.2.2  質(zhì)粒DNA的提取  采用堿裂解法［4］。挑取單個(gè)菌落，接種于7ml LB液體培養基（含抗生素）中，37℃、震蕩培養過(guò)夜（約12～14h）。取1.5ml培養物加入Eppendorf管中，4℃、12000×g離心1min，棄上清，使細菌盡可能干燥。將細菌重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ中，劇烈震蕩，使菌體分散。加200μl新配制的溶液Ⅱ，上下顛倒5次混勻，置冰上2min。加入150μl預冷的溶液Ⅲ，溫和的混勻10s，置冰上5min。4℃、12000×g離心7min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻1min，4℃、12000×g離心5min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。重復上一步驟再抽提1次。加入1/10體積的3mol/L NaAc混勻，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃、12000×g離心15min，去上清，室溫干燥。70%乙醇洗滌1次，室溫干燥5min。沉淀溶于20μl TE（含RNAse 20μg/ml）中，震蕩混勻，-20℃保存備用。

    1.2.3  感受態(tài)細胞的制備（氯化鈣法）［4］  從37℃過(guò)夜培養的大腸桿菌平板中挑取單一菌落，轉至2ml LB液體培養基中，37℃、震蕩培養過(guò)夜。取培養物1：40稀釋到新鮮LB液體培養基中，37℃繼續震蕩培養至吸光度值為0.4左右（約2.5h）。菌液冰浴10min，4℃、12000×g離心1min，棄上清。加1/2初始培養物體積預冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮菌體，冰浴10min，4℃、12000×g離心1min，棄上清。加1/25初始培養物體積預冷的0.1mol/L CaCl2溶液懸浮菌體，4℃保存備用。

    1.2.4  質(zhì)粒的轉化［4］  取200μl感受態(tài)細胞于1.5ml Eppendorf管中，加入3μl DMSO（二甲亞砜）混勻，加入10μl質(zhì)粒DNA混勻，置冰上30min。42℃水浴90s，迅速轉移到冰上30min。加滿(mǎn)LB液體培養基重懸菌體。37℃震蕩培養45min。將混合液涂在預熱的含有抗生素（100μg/ml）的LB固體培養板上，37℃過(guò)夜培養。觀(guān)察細菌生長(cháng)狀況，并挑取單個(gè)菌落接種培養。

    1.2.5  轉化菌株耐藥性的鑒定  將轉化菌株接種到含抗生素的瓊脂平板上，過(guò)夜培養，觀(guān)察轉化菌株的生長(cháng)狀況。并采取堿裂解法對其進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取。

    1.2.6  瓊脂糖凝膠電泳  用0.8%瓊脂糖（含0.5/ml溴化乙錠）100V電泳40min，紫外透射儀上觀(guān)察結果。

　　2  結果

    2.1  藥敏試驗結果  40株臨床分離大腸埃希菌對各種抗生素的耐藥結果見(jiàn)表1。表1  40株大腸埃希菌對9種抗生素的耐藥結果（略）從表1可知，40株大腸埃希菌對氨芐西林和青霉素的耐藥性較高，分別為87.5%和97.5%，對頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢拉定的耐藥率分別為17.5%、22.5%、40%、75%，紅霉素和阿奇霉素為82.5%和42.5%，鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥率為47.4%。

2.2  質(zhì)粒DNA提取結果  用堿裂解法對兩株耐藥菌株進(jìn)行質(zhì)粒的抽提，得到分子量都近似為3.0kb的質(zhì)粒。其結果見(jiàn)圖1。

    M：maker;1、2：提取質(zhì)粒

    圖1  質(zhì)粒電泳圖譜2.3  質(zhì)粒鑒定結果  將其中一株3.0kb的質(zhì)粒轉化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，接種在含氨芐西林（100μg/ml）的培養基上，挑取單個(gè)菌落接種于LB中培養12～24h，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)從轉化菌中提取的質(zhì)粒與原質(zhì)粒粉質(zhì)量相等。結果見(jiàn)圖2。

    M：maker;1：轉化質(zhì)粒；2：原質(zhì)粒

    圖2  質(zhì)粒及其轉化子

    2.4  轉化菌株耐藥性的鑒定結果  轉化菌對氨芐西林、青霉素、紅霉素、阿奇霉素、頭孢哌酮鈉、鹽酸環(huán)丙沙星耐藥，而對頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉敏感。

　　3  討論

    自20世紀90年代以來(lái)，隨著(zhù)三代頭孢為代表的β-內酰胺類(lèi)藥物的廣泛使用，細菌的耐藥性增加并出現了產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）的耐藥菌株的流行［5］。大腸埃希菌是產(chǎn)ESBLs主要代表菌之一，因此大腸埃希菌所引起的感染不應忽視其耐藥機制在給臨床治療方面所帶來(lái)的困擾，而產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶可以由質(zhì)粒編碼，所以質(zhì)粒在細菌耐藥機制方面起非常重要的作用。質(zhì)粒DNA上的ESBLs編碼基因常�？梢栽诮Y合性質(zhì)粒的tra操縱子、非結合性質(zhì)粒的啟動(dòng)系統（oriT及mob基因）、轉座子（Tn）以及整合子（Int）的作用下通過(guò)轉化、轉導、結合等方式在同種屬甚至不同種屬細菌的質(zhì)粒之間或質(zhì)粒與染色體間不斷轉移，導致更多的細菌產(chǎn)生ESBLs，并通過(guò)整合和重組使細菌產(chǎn)生多重耐藥性［6］。

    本項工作通過(guò)對40株臨床分離大腸埃希菌耐藥性的測定，發(fā)現其中大部分細菌呈現出多重耐藥，對傳統藥物如：青霉素、氨芐西林表現出較明顯的耐藥，其耐藥率分別高達97.5%和87.5%，對頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢拉定的耐藥率分別為17.5%、22.5%、40%、75%，紅霉素和阿奇霉素為82.5%和42.5%，鹽酸環(huán)丙沙星的耐藥率為47.4%。由此可見(jiàn)，抗生素的不合理使用已使一些抗生素失去了其抗菌作用，應引起社會(huì )和醫療界的重視。

    本次研究從兩株耐藥大腸埃希菌中提取出了兩種質(zhì)粒，其分子量均為3.0kb左右，經(jīng)轉化鑒定為耐藥質(zhì)粒。其轉化子表現出對氨芐西林、青霉素、紅霉素、阿奇霉素、頭孢哌酮鈉、鹽酸環(huán)丙沙星耐藥，而對頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉敏感，說(shuō)明該地區大腸埃希菌對氨芐青霉素等的耐藥性部分由質(zhì)粒決定，而其對抗生素的耐藥性則可能是由染色體介導的。由此可見(jiàn)，帶有耐藥基因的質(zhì)粒，在導致耐藥性的產(chǎn)生中扮演著(zhù)重要的角色，因此研究和開(kāi)發(fā)質(zhì)粒消除的藥物也顯得十分重要。

 作者：張帆，李菁華，史紅艷，孫延波    《中華醫學(xué)實(shí)踐雜志》

【參考文獻】

  1 Levy SB.Factors impacting on the problem of antibiotic resistance.J Antimicrob Chenother,2002,49:25.

2 康梅，陳超楊，Norman Hui,等.超產(chǎn)廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌的脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究.四川大學(xué)學(xué)報·醫學(xué)版，2004，35（2）：214-216.

3 趙靜，楊漢春.大腸桿菌耐藥性R質(zhì)粒研究進(jìn)展.中國獸醫雜志，1997，23（9）：44.

4 J·薩姆布魯克，EF·弗里奇，T·曼尼阿薩斯.分子克隆試驗指南，第2版.北京：科學(xué)出版社，1992，10.

5 Farrell DJ,Morrissey I,De Rubeis D,et al.A UK multicentre study of the antimicrobial susceptibility of bacterial pathogens causing urinary tract infection.J Infect,2003,46(2):94-100.

6 韓偉，張鐵，王春光，等.大腸埃希菌多重耐藥性的形成機制.動(dòng)物醫學(xué)進(jìn)展，2006，27（1）：51-53.

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