中藥對產(chǎn)β－內酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究

【摘要】  目的 對產(chǎn)β－內酰胺酶（ESBL+）大腸埃希菌進(jìn)行中藥體外敏感試驗，觀(guān)察其結構改變對中藥治療作用的影響。方法 采用瓊脂擴散法，以臨床收集的ESBL（+）大腸埃希菌30株為實(shí)驗組，非產(chǎn)酶的大腸埃希菌30株為對照組，進(jìn)行體外敏感性研究，所選中藥通過(guò)水提、醇提法制備藥液，觀(guān)察各種藥物的最低抑菌濃度。結果 所試中藥體外抑菌效果從強到弱依次為：半枝蓮水提液、蒲公英醇提液、射干醇提液、白頭翁醇提液、半枝蓮醇提液、魚(yú)腥草水提液、射干水提液、白頭翁水提液、魚(yú)腥草醇提液、蒲公英水提液。對實(shí)驗組與對照組細菌的抑菌效果經(jīng)統計學(xué)分析，差異無(wú)顯著(zhù)性（P>0.05）。結論 對ESBL(+)大腸埃希菌引起的感染，在抗生素選擇壓力增大的情況下，中藥可以成為治療的較好選擇，無(wú)需實(shí)驗室對其確認是否產(chǎn)酶。

【關(guān)鍵詞】  中藥；產(chǎn)β－內酰胺酶大腸埃希菌；非產(chǎn)酶大腸埃希菌；體外敏感性

    近年，產(chǎn)β－內酰胺酶（ESBL+）大腸埃希菌引起的各類(lèi)感染越來(lái)越多，治療此種細菌引起的感染，青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)及氨曲南是無(wú)效的。細菌的產(chǎn)酶及突變是否影響中藥的治療作用呢？這一方面未曾見(jiàn)有報道，為此筆者選擇了具有清熱解毒、清熱燥濕作用的中藥通過(guò)水提與醇提的方法制備藥液，對ESBL（+）大腸埃希菌進(jìn)行了體外敏感性的對比研究，并對有效中藥進(jìn)行篩選，現報告如下。

    1  實(shí)驗材料

    1.1  中藥選擇  魚(yú)腥草：三白草科植物蕺菜Horttuynia   cordata Thunb.的干燥地上部分，切段。射干：鳶尾科植物    射干Belamcanda chinensis(L.)DC.的干燥根莖，切片。蒲公英：菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、堿地蒲公英T.sinicum Kitag.或同屬數種植物的干燥全草，切段。半枝蓮：唇形科植物半枝蓮Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，切段。白頭翁：毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis(Bge.) Regel的干燥根，切薄片。以上藥物均購自我院中藥房。

    1.2  實(shí)驗菌株  來(lái)自本院門(mén)診及病房臨床標本中分離的大腸埃希菌（儀器：英國先德SENSITITRE全自動(dòng)微生物鑒定儀，鑒定符合率95%以上）。選擇經(jīng)鑒定為ESBL（+）大腸埃希菌30株為實(shí)驗組，ESBL(-)大腸埃希菌30株為對照組。

    ２  實(shí)驗方法

    2.1  中藥制備

    2.1.1  中藥水提液  取中藥魚(yú)腥草、射干、蒲公英、半枝蓮、白頭翁各500g，分別置提取容器中，加水適量，浸泡20min，繼續加水6～8倍（根據藥物容積不同，加水量不同），加熱煎煮提取2次（2h, 2h），過(guò)濾去渣，合并2次提取液，慢火濃縮至500ml左右（1g/ml），灌封，備用［1］。

    2.1.2  中藥醇提液  取中藥魚(yú)腥草、射干、半枝蓮、白頭翁各500g，分別置提取容器中，加65%乙醇適量，浸泡20min，繼續加提取溶劑6～8倍量，加熱煎煮提取2次（2h, 2h），過(guò)濾去渣，合并2次濾液，回收乙醇。慢火濃縮至500ml左右（1g/ml），灌封，備用［1］。

    2.2  ESBL確認  采用NCCLS推薦的抑制劑增強的紙片法進(jìn)行，若任一復合紙片抑菌圈直徑與單一紙片抑菌圈直徑相比≥5mm，即判為產(chǎn)ESBLs菌，若<5mm，則判為非產(chǎn)ESBLs菌。所選擇的30株ESBL(+)菌中，頭孢噻肟陽(yáng)性14株，頭孢噻肟、頭孢他啶二者均為陽(yáng)性者16株，無(wú)單純頭孢他啶陽(yáng)性菌株。

    2.3  菌液制備  挑取培養18～24h的純菌落，制成0.5麥氏單位，濃度相當于(1～1.5)×108cfu/ml的菌懸液，備用。

2.4  操作  先以打孔法進(jìn)行預試，瓊脂稀釋法配制濃度。采用2倍稀釋法，配制成６份不同濃度的供試藥液，濃度依次為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156，根據要求加入M-H瓊脂，裝瓶，滅菌，傾注平板。將每個(gè)平板分成若干份，編號。取10μl菌懸液加到平板表面，放35～37℃孵箱培養，24h觀(guān)察結果，并記錄，以48h無(wú)菌生長(cháng)之最低濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。

    3  結果

    經(jīng)48h培養觀(guān)察，實(shí)驗組及對照組細菌在含有不同濃度的中藥平板上表現出不同的生長(cháng)狀況，見(jiàn)圖1。其MIC結果見(jiàn)表1～3（為統計方便，對在濃度為0.5平板上仍有細菌生長(cháng)之最終濃度定為1.0）。表1  不同中藥對兩組細菌的MIC比較 表2  中藥的不同提純方法對實(shí)驗組細菌的MIC比較表3  中藥的不同提純方法對對照組細菌的MIC比較從表1中可以看出，中藥魚(yú)腥草醇提液、射干水提液、白頭翁水提液、蒲公英水提液對實(shí)驗組及對照組細菌的平均MIC值均在0.4以上，筆者認為其抑菌作用應視為較弱，但其復方的作用及在體內的作用如何尚有待進(jìn)一步研究。魚(yú)腥草水提液、射干醇提液、白頭翁醇提液、半枝蓮水提液、蒲公英醇提液對實(shí)驗組及對照組細菌在抑菌效果上經(jīng)統計學(xué)分析，差異無(wú)顯著(zhù)性（均P>0.05）。而半枝蓮醇提液對兩組細菌的MIC經(jīng)統計學(xué)分析，差異有顯著(zhù)性（P<0.05），醇提液對ESBL(+)大腸的作用優(yōu)于ESBL(-)。

    從表２、表３中可以看出，魚(yú)腥草水提液、半枝蓮水提液對兩組細菌的抑菌效果均優(yōu)于相應的醇提液，而射干醇提液、白頭翁醇提液、蒲公英醇提液無(wú)論對實(shí)驗組細菌還是對對照組細菌抑菌效果均明顯優(yōu)于相應的水提液，其MIC值經(jīng)統計學(xué)分析，差異有非常顯著(zhù)性（均P<0.01）。

    4  討論

近年來(lái)，由于抗生素的不合理應用，使細菌的耐藥性增強，多重耐藥菌株不斷增加，在醫院的各類(lèi)感染中，革蘭陰性細菌仍是主要的感染菌，而其中又以大腸埃希菌為多［2］。大腸埃希菌是產(chǎn)酶的主要細菌，其產(chǎn)β－內酰胺酶的細菌分離率逐漸增加［3］。該酶是質(zhì)粒介導的耐藥酶，它不僅能水解青霉素和第一、二代頭孢菌素，還能水解第三代頭孢菌素及氨曲南等，并且ESBL的耐藥基因編碼經(jīng)常與其他的耐藥基因相聯(lián)結，從而使耐藥性更加復雜，抗生素選擇更加困難，出現了“抗生素耐藥危機”，給臨床治療帶來(lái)極大難度。目前針對非產(chǎn)酶大腸的中藥研究報道較多，但產(chǎn)酶大腸的諸多改變能否對中藥的抑制作用產(chǎn)生影響，這方面的研究鮮有報道，筆者選擇了具有清熱解毒、清熱燥濕作用的中藥12味，并對其中的魚(yú)腥草、射干、半枝蓮、蒲公英、白頭翁進(jìn)行醇提、水提對比，為中藥在對抗特殊耐藥菌方面的作用提供了科學(xué)有效的實(shí)驗資料，對中藥的推廣應用將產(chǎn)生重要意義。

  作者：吳國英，欒耀芳，孫進(jìn)學(xué)，王軍，孔祥山 《中華醫學(xué)實(shí)踐雜志》

【參考文獻】

  1 謝秀瓊.現代中藥制劑新技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004,4.

2 古東東，段蘊鈾，張紅鷹，等.臨床標本細菌分離及細菌耐藥性監測.中藥醫院感染學(xué)雜志，2003,13(1):67-70.

3 周田美，董曉勤，施新顏，等.產(chǎn)超廣譜β－內酰胺酶的檢測及藥敏分析.中華醫院感染學(xué)雜志，2003,13(5):484-485.

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