腸道菌群失調對免疫細胞及細胞因子的影響

【摘要】  目的探討菌群失調對機體免疫細胞和細胞因子的影響。方法用卡那霉素制作小鼠腸道菌群失調的動(dòng)物摸型，進(jìn)行腸道菌群的定量分析，同時(shí)進(jìn)行免疫細胞和細胞因子相關(guān)指標的測定。結果實(shí)驗組小鼠腸道內菌群數量明顯低于對照組（P<0.01）。菌群失調后實(shí)驗組小鼠較對照組脾細胞數、脾抗體形成細胞數減少，脾重量減輕（P<0.05或P<0.01）；實(shí)驗組小鼠血清白細胞介素-2（IL��2）和粒�簿奘杉毎�集落刺激因子（GM�睠SF）的含量較對照組低（P<0.01）。結論腸道菌群失調可減少機體的免疫細胞及降低細胞因子。

【關(guān)鍵詞】  小鼠；菌群失調；免疫細胞；細胞因子

 人和動(dòng)物體內存在大量有益菌，這些菌不但對機體無(wú)毒、無(wú)害，而且參與宿主的消化、營(yíng)養、代謝、吸收、免疫及抗感染的過(guò)程。大量研究證明，它在維持機體健康的微生態(tài)平衡中起著(zhù)重要的作用。我們應用抗生素脫污染使小鼠腸道菌群失調，然后觀(guān)察對機體免疫細胞及細胞因子的影響。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗動(dòng)物

    純系BALB/C小鼠80只，8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，由河北醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物學(xué)部提供。

    1.2 實(shí)驗材料

    卡那霉素由中國藥品生物制品鑒定所提供; 非選擇性培養基和選擇性培養基EMB、EC、BS、LBS（分別培養腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌）均由天津金章醫用新技術(shù)研究所提供；豚鼠補體由本實(shí)驗室制備。

    1.3 實(shí)驗方法

    1.3.1 動(dòng)物模型制備［1］

    將實(shí)驗動(dòng)物隨機抽取實(shí)驗組和對照組，每組10只。實(shí)驗組小鼠卡那霉素50 mg（稀釋量為0.4 ml）灌胃，每天上午1次，連續10 d；對照組小鼠蒸餾水0.4 ml灌胃，方法及天數同實(shí)驗組。所有小鼠10 d后采取摘眼球放眶血方法處死，盲腸內容物用于腸道菌群的培養，驗證動(dòng)物模型是否準確建立。

    1.3.2 小鼠腸道菌群和脾重量的檢測

    實(shí)驗組和對照組小鼠各10只,按上述方法制作動(dòng)物模型,然后放眶血處死。取盲腸內容物0.1 g，置于放有玻璃球的小瓶中，加入0.9 ml無(wú)菌生理鹽水，加蓋，200 r/min在振蕩器上振蕩15 min，均質(zhì)化的標本稀釋度為10-1，從此混合液中吸取0.2 ml，再加1.8 ml無(wú)菌生理鹽水，混勻，此標本稀釋度為10-2，繼續進(jìn)行10倍稀釋至10-8。采用Mile與Misra所介紹的方法接種，每個(gè)稀釋度定量接種3個(gè)液滴。選擇適當的計算菌落的稀釋度進(jìn)行菌落計算。結果以L(fǎng)og的菌落形成單位/克(CFU/g)表示。小鼠處死后用75％酒精浸泡2 min，取出后固定在蠟盤(pán)上，解剖腹腔，將脾臟與周?chē)�組織分離取出，用濾紙吸除黏附的血液后，稱(chēng)重。

    1.3.3 脾抗體形成細胞(PFC)測定

    實(shí)驗組和對照組各10只小鼠，每日每只50 mg卡那霉素灌服。服藥3 d后，同時(shí)用綿羊紅細胞（SRBC）免疫，5% SRBC腹腔注射0.4 ml，連續免疫4 d，再喂藥7 d后，斷頸處死小鼠，取出脾臟。將小鼠脾臟用100目鋼網(wǎng)和注射器芯研磨制成單個(gè)脾細胞懸液，用Hank液洗兩遍，1 000 r/min，離心15 min，每個(gè)脾細胞加6 ml Hank液混勻。取24孔板，每孔加180 μl Hank液，50 μl 1∶3稀釋的豚鼠補體，50 μl　10％SRBC，20 μl脾細胞，混勻，填充小室，蠟封小室邊緣，37℃ 1.5 h溫箱孵育，計數小室內空斑數量。

    1.3.4 白細胞介素(IL)��2和粒�簿奘杉毎�集落刺激因子(GM�睠SF)測定

    實(shí)驗組和對照組各10只小鼠,模型建立和免疫同上,小鼠摘眼球處死，取眼眶靜脈血于試管中，靜置1 h后，離心，取血清。采用雙抗體夾心ELISA法分別按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測。待測血清中的IL��2、GM�睠SF與包被抗小鼠IL��2、GM�睠SF單抗體結合，加入酶標抗體后形成復合物，后者與底物作用呈現顯色反應，429 nm處測OD值，IL��2、GM�睠SF濃度與OD值成正比。檢測程序：①建立標準曲線(xiàn)；②加樣：待測品孔每孔各加入待測樣品100 μl；③將反應板充分混勻后置37℃,120 min；④洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，濾紙上印干；⑤每孔中加入第一抗體液50 μl，將反應板置37℃,60 min，洗板同前；⑥每孔加酶標抗體工作液100 μl，將反應板置37℃,60 min，洗板同前；⑦每孔加底物工作液100 μl，置37℃暗處反應5～10 min，每孔加入1滴終止液混勻；⑧在429 nm處測吸光度值；⑨在半對數紙上畫(huà)出標準曲線(xiàn)，根據樣品的A值在曲線(xiàn)上查出相應的IL��2、GM�睠SF含量。

2 結果

    2.1

    腸道正常菌群 見(jiàn)表1。 表1腸道正常菌群的測定結果

    2.2脾臟相關(guān)指標見(jiàn)表2。 表2脾臟相關(guān)指標的測定結果見(jiàn)表3。表3細胞因子的測定結果

　　3 討論

正常情況下，人體腸道內菌群與宿主間存在著(zhù)相互依賴(lài)、相互制約的微生態(tài)平衡［2］，這種平衡的破壞，會(huì )對機體的許多生理功能造成影響，如免疫功能和造血功能等�？股�素能對微生態(tài)平衡造成破壞已被學(xué)界所關(guān)注。本實(shí)驗采用給小鼠灌服卡那霉素10 d后，經(jīng)檢測發(fā)現，小鼠腸道雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌的數量減少，此發(fā)現進(jìn)一步說(shuō)明抗生素可破壞腸道的微生態(tài)平衡，造成腸道菌群紊亂。脾臟是各類(lèi)免疫細胞聚集的器官，也是對抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應答及免疫效應物質(zhì)（如抗體等）的重要器官。研究發(fā)現，菌群失調或正常菌群數量的減少會(huì )使宿主的脾細胞增殖功能及IL��1和IL��2的活性明顯降低［3，4］。本實(shí)驗發(fā)現，菌群失調后會(huì )使小鼠脾臟重量減輕，脾細胞數和脾抗體形成細胞數減少，脾細胞內IL��2的含量降低，結果提示由于缺乏正常菌群作為免疫原性物質(zhì)刺激，影響了脾臟的正常發(fā)育，使脾臟萎縮和脾細胞功能低下，從而不但降低機體的特異性免疫功能，同時(shí)由于IL��2的含量的減少，還會(huì )降低非特異性免疫功能。Simon等［5］研究發(fā)現菌群失調會(huì )影響骨髓循環(huán)干細胞的數量，GM�睠SF是造血細胞因子家族的成員，主要由T淋巴細胞在抗原或絲裂原刺激下產(chǎn)生。本研究發(fā)現菌群失調后GM�睠SF的含量較正常小鼠減少，造成機體造血功能降低。從另一方面反映出正常菌群可刺激機體的造血功能，刺激造血細胞因子GM�睠SF的分泌。在人腸道正常菌群中大約有400多種細菌［6］，雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌和腸球菌等是優(yōu)勢菌群。我們通過(guò)給小鼠抗生素灌胃，觀(guān)察了機體腸道菌群的變化，同時(shí)觀(guān)察了菌群失調后對機體免疫細胞及細胞因子的影響，結果提示抗生素可造成腸道正常菌群的失調，并且菌群失調后可對機體免疫細胞和細胞因子產(chǎn)生明顯影響，為研究機體免疫功能和造血功能提供了理論基礎，也提示臨床醫生要合理使用抗生素等，以減少菌群失調對機體產(chǎn)生的不良影響。

 

作者：張亞超 王沛　張玉玲　孫曉麗　劉穎　王仁杰   《白求恩軍醫學(xué)院學(xué)報》

  1 康白.正常菌群檢測法.見(jiàn)：范明遠，主編.康白論文集.第1版.北京微生態(tài)學(xué)雜志編輯部.1989.101��110.

2 康白.微生態(tài)學(xué)原理.大連:大連出版社,2002.1.

3 Nicaise P， Gleizes A，Sandre C，et al.Modulation of aspecific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through femented milk intake.FEMS Immunol Med Microbiol，1998,48（6）:585��595.

4 孫延波,盛學(xué)成. 脫污染小鼠免疫功能的實(shí)驗研究.中國微生態(tài)學(xué)雜志，1995,7(2):1��3.

5 Simon D，Henk G，Froukje de B，et al.Influence of high versus low intestinal concentration of Gram�瞡egative bacteria and Endotoxin on the susceptibility　of murine myelopoiesis in bone marrow and spleen to cytostatic treatment with Ara�睠. Leuk Research,1992,16(10):985��991.

6 康白.微生態(tài)學(xué)正在迅猛發(fā)展.中國微生態(tài)學(xué)雜志，1995，7（4）：1.