肺炎鏈球菌轉化模型的建立

【摘要】  目的： 建立一種更加穩定、高效的肺炎鏈球菌實(shí)驗室轉化模型，以便于對該菌的各種目的基因進(jìn)行重組改造. 方法： 分別用改進(jìn)方法和既往方法制備肺炎鏈球菌感受態(tài)細胞，轉化外源DNA，獲取發(fā)生了轉化的菌株，通過(guò)抗生素培養基培養和PCR鑒定是否發(fā)生轉化；并計數抗生素篩選平板上的轉化菌落，比較兩者的轉化率，以確定更佳的轉化模型. 結果： 肺炎鏈球菌334菌株、31203菌株用改進(jìn)方法的轉化率分別為（0.89±0.20）％，（0.71±0.10）％，高于既往方法的轉化率［分別為(6.2±1.4)×10-3％，(5.7±1.1)×10-3 ％］，構建了肺炎鏈球菌感受態(tài)缺陷菌株，建立了改進(jìn)的肺炎鏈球菌實(shí)驗室轉化模型. 結論： 改進(jìn)的轉化模型實(shí)現了穩定的肺炎鏈球菌實(shí)驗室轉化，能方便研究者對該菌進(jìn)行各種遺傳操作，為深入研究其致病的分子機制提供了一個(gè)技術(shù)平臺.

【關(guān)鍵詞】  肺炎鏈球菌；轉化，細菌；感受態(tài)

　　【Abstract】 AIM: To establish a transformation model of Streptococcus pneumoniae(S.pn) in laboratory to promote the transformation efficiency and reconstruct its chromosome gene by improving the previous transformation method. METHODS: The competence cells of S.pn were prepared using both the previous and improved methods. After the exotic DNA was transformed under certain cell density, the transformed colonies on antibiotic plate, which was identified by growing in antibiotics culture and PCR, were counted to compare their transformation rate. RESULTS: The improved transformation model of S.pn in laboratory was established. The transformation rate of S.pn 334 was （0.89±0.20）％ and S.pn 31203 was （0.71±0.10）％ under the improved transformation model, which was relatively higher. Using this model, we constructed 4 S.pn competence�瞕efective strains. CONCLUSION: In laboratory, the improved transformation model can raise the transformation rate of S.pn, which induces different S.pn into competence, and provides a research technology for further investigation on pneumococcal pathogenesis.

 

　　【Keywords】 occus pneumoniae; transformation, bacterial; competence

　　0  引言

   

　　轉化是指細菌在自然生長(cháng)狀態(tài)下可自發(fā)形成感受態(tài)（特指細菌能夠攝取外來(lái)游離DNA的一種狀態(tài)），攝取外源性DNA，通過(guò)同源重組導致基因發(fā)生改變的過(guò)程. 通過(guò)轉化可以改造細菌基因，進(jìn)行功能基因組研究，它是研究肺炎鏈球菌（S.pn）生物學(xué)功能的重要手段. 本課題組既往的S.pn實(shí)驗室轉化模型［1］有兩大弊端：一是轉化效率不穩定；二是感受態(tài)開(kāi)放時(shí)間較短，不能滿(mǎn)足大規模轉化的需要. 有研究［2］認為冷刺激可能會(huì )延長(cháng)感受態(tài)開(kāi)放時(shí)間，我們據此對既往轉化模型進(jìn)行改良，即冷凍處理細胞后再做轉化，以期克服其弊端.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料   S.pn血清4型標準菌株TIGR4(ATCC�睟AA334)，干粉（美國ATCC微生物菌種保存中心）；S.pn血清3型標準菌株CMCC(B)31203，干粉（中國藥品生物制品檢定所醫學(xué)微生物菌種保存中心）；SⅡ型S.pn(1和2號菌株)由中國醫科院提供；主要遺傳特征經(jīng)鑒定合格. C+Y培養基：含5 g/L Yeast提取物（Lacks and Hotchkiss, 1960）；TSA 血平板：含50 mL/L兔脫纖維全血. 感受態(tài)刺激因子（CSP2）由挪威生命科學(xué)大學(xué)Havarstein LS教授惠贈；S.pn CP1250的染色體DNA（含有鏈霉素抗性基因str）由美國Morrison教授惠贈；S.pn 1d菌株的基因組DNA(含紅霉素抗性基因erm 的comE斷裂基因)由本課題組構建［3］；DNA提取試劑盒（上海華舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）. 722分光光度儀（上海儀器分析三廠(chǎng)）；-80℃低溫冰箱（日本SANYO Medical freezer MDF330型）.

　　1.2  方法

　　1.2.1  S.pn的生長(cháng)曲線(xiàn)繪制  挑取S.pn單個(gè)菌落接種于C+Y培養基，37℃培養12 h，轉接于20 mL C+Y培養基中，于37℃水浴孵育，從1 h后開(kāi)始在分光光度儀上測菌液A620 nm值，之后每隔1 h取樣1次. 以時(shí)間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制細菌的生長(cháng)曲線(xiàn).

　　1.2.2  改進(jìn)的S.pn實(shí)驗室轉化模型的建立

　　1.2.2.1  改進(jìn)的S.pn實(shí)驗室轉化模型  取凍存于-80℃冰箱的S.pn菌株，培養于CTM培養基（含C+Y培養基，1 mmol/L CaCl2，0.1 g/L BSA）中，37℃水浴至A550 nm＝0.1左右時(shí)，將甘油加入上述菌液中，至其終濃度為100 mL/L，分裝后凍于-80℃，此即為S.pn感受態(tài)細胞；24 h后取出凍存菌液，在冰上融化，9000 g離心1 min，棄去上清液，加入100 μL C+Y培養基（pH8.0），使沉淀徹底懸浮，加入CSP20 μg/L，同時(shí)加入S.pn CP1250的染色體DNA 100 μg/L，于37℃孵育90 min，鋪于含200 mg/L鏈霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培養24～48 h，即得到轉化菌落.

 

　　1.2.2.2  方法學(xué)比較  取凍存于-80℃冰箱的S.pn菌株，分別用上述改進(jìn)方法和既往方法［1］制備S.pn感受態(tài)細胞，然后加入CSP2 20 μg/L，并加入S.pn CP1250的染色體DNA100 μg/L，于37℃孵育90 min，鋪于含200 mg/L鏈霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培養24～48 h，計數抗生素血平板上的轉化菌落. 轉化率=平板菌落數/細菌總數×100%. 其中，細菌總數按A620 nm=0.6時(shí)， 細菌數為5 × 1011 cfu／L計算.

　　1.2.3  S.pn感受態(tài)缺陷菌株的制備及鑒定

　　1.2.3.1  感受態(tài)缺陷菌株的制備  用上述改進(jìn)的轉化方法制備S.pn感受態(tài)細胞，然后加入CSP2 20 μg/L，及含comE斷裂基因的染色體DNA（即S.pn 1d菌株DNA）100 μg/L，于37℃孵育90 min，鋪于含0.25 mg/L紅霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培養24～48 h，挑取平板上的轉化菌落，接種于含0.25 mg/L紅霉素的C+Y培養基中，37℃培養增菌，當菌密度為A620 nm=0.2左右時(shí)，凍于－80℃冰箱保存，即得到缺陷菌.

　　1.2.3.2  感受態(tài)缺陷菌株的鑒定  鑒定1：將野生菌和缺陷菌同時(shí)做轉化，選用CP1250的DNA為外源基因. 鑒定2：提取野生菌和缺陷菌的染色體DNA，用comE（5′�睺GCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG��3′，5′�睞CCAACGGACCTTCTATCTGTAGC��3′）和erm（5′�睠CGGGCCCAAAATTTGTTTGAT��3′， 5′�睞GTCGGCAG�睠GACTCATAGAAT��3′）的引物［4］做PCR. 加入comE或erm的上、下游引物5 μmol/L，加入MgCl2 2.5 μmol/L，Taq plus DNA聚合酶1 U. 循環(huán)參數為95℃ 5 min預變性；94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min. 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

   

　　統計學(xué)處理：根據資料類(lèi)型采用t檢驗，以P<0.05為差別有統計學(xué)意義(雙側).

2  結果

　　2.1   S.pn的生長(cháng)曲線(xiàn)   S.pn菌株334和31203的生長(cháng)曲線(xiàn)無(wú)明顯差別，生長(cháng)情況基本一致（圖1）.

　　圖1  肺炎鏈球菌334和31203菌株的生長(cháng)曲線(xiàn)（略）

　　2.2  改進(jìn)的S.pn實(shí)驗室轉化模型   獲得S.pn 334和31203菌株的轉化菌株，轉化率分別為1.03％和0.82％. 方法學(xué)比較實(shí)驗結果顯示，S.pn菌株334和31203用改進(jìn)轉化模型后，兩株細菌的轉化率皆比用既往轉化模型的轉化率高兩個(gè)數量級，差異有統計學(xué)意義（P<0.05，表1），改進(jìn)轉化模型的轉化效率明顯優(yōu)于既往轉化模型.

　　表1  肺炎鏈球菌（S.pn）334和31203菌株用不同轉化模型的轉化率比較（略）

　　aP<0.05 vs 既往方法.

　　2.3  S.pn感受態(tài)缺陷菌株的獲得  利用含comE斷裂基因的染色體DNA轉化S.pn 334，31203，1和2號菌，分別得到轉化菌落，即為S.pn感受態(tài)缺陷菌，轉化率分別為0.90％，0.75％，6.80％和9.40％. 鑒定1：將野生菌和缺陷菌同時(shí)轉化抗鏈霉素(str)的DNA，野生菌獲得轉化菌株，而缺陷菌無(wú)一個(gè)菌落生長(cháng). 鑒定2：以野生菌和缺陷菌的染色體DNA為模板，以comE和erm的引物做PCR，缺陷菌分別在1515 bp和726 bp處有產(chǎn)物，而野生菌則無(wú)這兩個(gè)片段的產(chǎn)物（圖2）.  

 

　　M： 2000 bp ladder DNA maker；1～4：獲得的S.pn 334，31203，1，2號菌株的感受態(tài)缺陷菌DNA含有erm基因；5～8：獲得的S.pn 334，31203，1，2號菌株的感受態(tài)缺陷菌DNA含有com E斷裂基因.

　　圖2  肺炎鏈球菌感受態(tài)缺陷菌株（略）

　　3  討論

   

　　S.pn是自然界可以發(fā)生自然轉化的一種條件致病菌，在目前發(fā)現的可以發(fā)生自然轉化的幾種細菌中，S.pn的轉化率最高［5］. 轉化后可發(fā)生基因同源重組，因而還是基因敲出、基因突變的有利工具，對于細菌功能學(xué)的研究很有幫助，因此我們需要掌握S.pn在實(shí)驗室的穩定、高效的轉化模型，以便于對其基因功能以及致病機制進(jìn)行深入研究. S.pn的轉化受密度感應系統的控制，當細菌生長(cháng)到一定密度時(shí)，感受態(tài)會(huì )受到抑制，自然狀態(tài)下，S.pn感受態(tài)開(kāi)放時(shí)間僅十幾分鐘，所以很難在實(shí)驗室條件下捕捉到S.pn的自然轉化. 人工純化合成的CSP能誘導S.pn轉化，使S.pn在實(shí)驗室轉化成為現實(shí). 然而既往的轉化模型不夠穩定，且不適合大量連續的實(shí)驗室轉化，有待改進(jìn). S.pn的莢膜較厚，會(huì )妨礙外源DNA的轉入，冷凍處理可能會(huì )減弱S.pn莢膜的形成，使其轉化率增加［6］，且有研究認為冷刺激會(huì )延長(cháng)細菌感受態(tài)開(kāi)放時(shí)間，因此我們在細菌自然生長(cháng)合適的菌密度時(shí)（許多研究認為此時(shí)S.pn處于自然轉化期）冷凍S.pn感受態(tài)細胞，然后利用CSP進(jìn)一步誘導S.pn轉化.

   

　　本課題組的前期實(shí)驗［1］已摸索出適合S.pn31203的轉化培養基、pH及培養時(shí)間（菌密度）等，我們通過(guò)繪制31203菌株和334菌株的生長(cháng)曲線(xiàn)，發(fā)現兩者的生長(cháng)情況基本一致，因此對334菌株采用相同的轉化體系和條件. 我們的結果顯示，在實(shí)驗室條件下，運用選定的轉化體系和條件，能將外源DNA轉入細菌，且改變了細菌的生物學(xué)性狀，使其產(chǎn)生了抗生素抗性，成功地建立了改進(jìn)的S.pn實(shí)驗室轉化模型. 兩種菌株采用改進(jìn)的轉化模型后，其轉化率均明顯高于既往轉化模型，說(shuō)明冷凍處理感受態(tài)細胞能有效提高其轉化率；且改進(jìn)模型可以一次制備大量S.pn感受態(tài)細胞，操作簡(jiǎn)便，可連續使用感受態(tài)細胞. 因此改進(jìn)的S.pn實(shí)驗室轉化模型相當穩定、高效.

   

　　comE是調控S.pn感受態(tài)的關(guān)鍵基因，各種環(huán)境因素對S.pn轉化發(fā)生的調節都是通過(guò)直接或間接方式影響comE的表達來(lái)實(shí)現的［7-8］. 我們選用該基因為目的基因，將含comE斷裂基因的DNA轉入野生菌，得到感受態(tài)缺陷菌株，實(shí)驗證明這些缺陷菌的確不能發(fā)生轉化，可用于下一步相關(guān)研究. 說(shuō)明可以通過(guò)穩定的實(shí)驗室轉化模型，改造那些具有自然轉化特性的細菌（如S.pn）的各種基因，進(jìn)而觀(guān)察細菌發(fā)生的變化. 采用這種模型方便了對細菌進(jìn)行各種遺傳操作，為深入研究其致病的分子機制提供了一個(gè)技術(shù)平臺.

　作者：趙清，李南，張雪梅，胥文春，朱興華，張群，尹一兵《第四軍醫大學(xué)學(xué)報》

  　�。�1］ 孟江萍，尹一兵，張雪梅，等. 肺炎鏈球菌轉化模型的建立與優(yōu)化［J］. 微生物學(xué)雜志，2006，26（1）：10-13.

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