毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌定量研究

【摘要】  目的：定量研究毛細管區帶電泳法（CZE）分離大腸埃希菌（E.coli）以滿(mǎn)足臨床診斷要求。方法：用毛細管區帶電泳法對E.coli ATCC25922進(jìn)行分離，研究其峰高與E.coli量的關(guān)系。結果：毛細管區帶電泳法分離E.coli ATCC25922濃度在105cfu/ml～5×107cfu/ml之間線(xiàn)性很好，其峰高與濃度關(guān)系符合線(xiàn)性方程：㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C, R2＝1。結論：CZE法分離大腸埃希菌可進(jìn)行定量研究。

【關(guān)鍵詞】  毛細管區帶電泳；分離；大腸埃希菌

    [Abstract]   Objective:A quantitative study about determination of Escherichia coli （E.coli）by capillary zone electrophoresis（CZE） was to meet the clinic diagnosis request. Methods:We determined E.coli ATCC25922 by CZE and studied the linear relationship between the peak height (mAU) and the Escherichia coli concentration (C). Results:The linear relationship of  E.coli ATCC25922 concentration determined by CZE between 105cfu/ml and 5×107cfu/ml was quite good. Regression line equation is ㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C, R2＝1.Conclusion: Escherichia coli ATCC25922   determined by capillary zone electrophoresis could be used for a quantitative study.

    [Key words]   Capillary zone electrophoresis； Separation； Escherichia coli大腸埃希菌是臨床常見(jiàn)感染菌之一，由其引起的泌尿系統感染占53.6%[1]，其診斷主要靠細菌培養法定量分析，但該法耗時(shí)較長(cháng)（通常需2～4天）。毛細管區帶電泳是20世紀80年代發(fā)展起來(lái)的一種高效分離技術(shù)，具有快速、靈敏、低耗等優(yōu)點(diǎn)，可用于研究多種細菌的分離[2]。毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌ATCC25922定量研究，將有利于快速診斷，滿(mǎn)足臨床要求。

    1   材料和方法

    1.1   儀器   Beckman-Coulet P/ACE MDQ 毛細管電泳儀和 UV檢測器, 河北永年銳灃色譜器件公司未涂層石英硅毛細管（內徑75μm），上海天達pHS-3TC pH計（0.01級）。

    1.2   試劑和菌株來(lái)源   聚氧化乙烯（PEO）、Tris和EDTA(Sigma-Aldrich公司)，硼酸、氫氧化鈉、鹽酸（上�；瘎�廠(chǎng)分析純級），實(shí)驗用水為雙蒸餾水。采用上述材料配制TBE貯存緩沖液（4.5mmol/L TRIS-4.5mmol/L硼酸-0.1mmol/L EDTA，pH8.6），將其1∶16稀釋?zhuān)�添加終濃度為0.0125%的PEO(Mn 600000)，并用0.1mmol/L NaOH和鹽酸調整pH至9.0，作為電泳緩沖液待用。E.coli ATCC 25922（衛生部臨床檢驗中心）。

    1.3   方法

    1.3.1   電泳方法   采用內徑75μm、有效長(cháng)度（進(jìn)樣端至檢測窗口）為40cm的石英毛細管，陽(yáng)極0.5psi壓力進(jìn)樣20s，電壓25kV，電泳時(shí)間15min，25℃恒溫，陰極檢測，波長(cháng)214nm。開(kāi)機后及每一份標本檢測前依次用1.0mol/L氫氧化鈉、 雙蒸餾水、電泳緩沖液20psi沖洗毛細管5min。

    1.3.2   檢測方法   將血瓊脂平板上經(jīng)35℃，18~24h培養的E.coli ATCC 25922的菌落挑于電泳緩沖液中，配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml，靜置30min后進(jìn)行毛細管區帶電泳。

    1.4   統計學(xué)方法   使用SPSS 11.5 for windows 軟件對數據進(jìn)行統計學(xué)分析。

2   結      果

    2.1   CZE分離E.coli定量電泳圖   在相同條件下，應用毛細管區帶電泳法分離濃度為5×107、107、106、5×105和105cfu/ml的大腸埃希菌,譜峰高度分別為316、61、6.2、2.84和0.62 mAU（毫吸光度），峰形尖銳，分離效率高。電泳圖譜見(jiàn)圖1。        

    2.2   CZE分離E.coli峰高與濃度的線(xiàn)性關(guān)系   根據5次定量試驗結果，對大腸埃希菌濃度（C）和相應檢測的峰高（mAU）分別取對數，以㏑C為橫坐標，㏑mAU為縱坐標，作回歸曲線(xiàn)，線(xiàn)性方程為：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1。

    3   討      論

    細菌為膠體顆粒，比表面積極大，且覆蓋著(zhù)多糖類(lèi)、肽聚糖、脂類(lèi)等物質(zhì)，這些化合物在電泳緩沖液中可因解離和吸附形成雙電層；因而，毛細管區帶電泳將細菌當作“離子”看待，以高壓直流電場(chǎng)為驅動(dòng)力，以毛細管為分離通道，在電滲流作用下達到高效聚焦和分離[3，4]。毛細管區帶電泳法已成功分離了多種細菌，并取得非常高的分離峰效應（高達10-9表觀(guān)理論塔板/m）[5]。我們發(fā)現大腸埃希菌ATCC25922通常保持較高的存活率，極易聚集出現雜峰，影響分離度。消除聚集可在電泳前使大腸埃希菌與運行緩沖液充分混勻后靜置30min以利于緩沖液和添加劑充分與大腸埃希菌作用，形成相對穩定的單個(gè)離子減小聚集。

    本研究顯示毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌濃度在105～5×107cfu/ml時(shí)定量實(shí)驗敏感性好、分離效率高，峰高與大腸埃希菌濃度的線(xiàn)性關(guān)系較好，可依據峰高用回歸方程分析大腸埃希菌濃度, 回歸方程：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1；對于菌量<105cfu/ml，本試驗可將菌液進(jìn)行10倍濃縮，提高濃度后檢測。

隨著(zhù)毛細管區帶電泳技術(shù)自動(dòng)化操作的實(shí)現，利用其快速、高效、重復性好等優(yōu)點(diǎn)，為臨床快速、批量分離和分析微生物提供了一個(gè)很好的選擇性手段[6]。盡管毛細管區帶電泳法分析微生物還存在著(zhù)一些亟待解決的問(wèn)題[7]，但本研究顯示經(jīng)過(guò)實(shí)驗條件的優(yōu)化，其在微生物的分離和分析中可以得到很好的結果；毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、溶劑消耗少、環(huán)境污染小，具有較高的研究?jì)r(jià)值和前景。

 

   作者：王朔　王惠民，褚少朋，汪桂華 《南通大學(xué)學(xué)報（醫學(xué)版）》

  [1] 喻 華,劉 華,顏英俊,等.尿路感染病原菌分布及耐藥性檢測[J].中華醫院感染學(xué)雜志,2003，13（10）:983.

[2] 鄧延倬，何金蘭. 高效毛細管電泳[M].第1版.北京：科學(xué)出版社，2000：5.

[3] Jinjian Zheng,Edwardm S Yeung. Mechanism of microbial aggregation during capillary electrophoresis[J]. Anal Chem, 2003,75: 818-824.

[4] Meera J Desai，Daniel W. Armstrong. Separation, identification, and characterization of microorganisms by capillary electrophoresis[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003, 67（2）:38-51.

[5] Armstrong, DW, Schneiderheinze JM. Rapid identification of the bacterial pathogens responsible for urinary tract infections using direct injection CE[J]. Anal Chem, 2000,72（2）:4474-4476.

[6] 林炳承.毛細管電泳導論[M].第1版. 北京：科學(xué)出版社，1996：76.

[7] Armstrong, DW, Girod M, He L, et al. Mechanistic aspects in the generation of apparent ultra-high efficiencies for colloidal (microbial) electrokinetic separations[J]. Anal Chem, 2002,74（3）:5523-5530.