如何提高抑菌試驗速度的探討

【摘要】  目的 探討基層檢驗機構如何進(jìn)行快速、準確的抑菌試驗。方法 用慶大霉素標準藥敏紙片對ATCC25922、ATCC25923進(jìn)行K-B法操作，觀(guān)察結果分4個(gè)試驗組和1個(gè)對照組，每組操作重復10次，4個(gè)試驗組分別培養4h，4.5h，5h，5.5h，使用普通光學(xué)顯微鏡放大160倍觀(guān)察細菌生長(cháng)情況，根據抑菌圈直徑進(jìn)行初步判斷，對照組培養20h肉眼觀(guān)察，根據抑菌圈直徑進(jìn)行最終判斷。結果第4h，4.5h觀(guān)察的結果與其他各組比較差異有顯著(zhù)性(P<0.05)；第5h，5.5h和20h觀(guān)察的抑菌直徑相比差異無(wú)顯著(zhù)性（P>0.05），說(shuō)明第5h，5.5h的初步判斷與第20h的最終判斷吻合。結論普通光學(xué)顯微鏡放大160倍觀(guān)察細菌生長(cháng)可以加快藥敏診斷速度。

【關(guān)鍵詞】  抑菌實(shí)驗；抑菌圈直徑；集落計數，微生物；細菌學(xué)

　　抑菌試驗是診斷細菌和指導臨床使用藥物以及檢驗新藥藥效的重要實(shí)驗�；鶎訖z驗機構在無(wú)VITEK-32自動(dòng)檢測系統［1］、分光光度計等儀器設備的情況下，如何提高藥敏紙片抑菌試驗的質(zhì)量和速度是非常重要的。我們在長(cháng)期的藥敏試驗中進(jìn)行探討和總結，得出了以下方法，供大家參考。

　　1.1  材料  Muller-hinton Agar（杭州天和微生物試劑有限公司）、ATCC25922、ATCC25923（中國普通微生物保藏管理中心），GEN（慶大霉素紙片，杭州天和微生物試劑有限公司）、MOTIC普通光學(xué)顯微鏡（上海精密儀器儀表有限公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  按每1000ml蒸餾水稱(chēng)取Muller-hinton Agar 38g配備M-H瓊脂，按每個(gè)平皿（直徑9cm）25ml進(jìn)行分裝�！�

　　1.2.2  將孵育16～24h的ATCC25922、ATCC25923菌落分別接種于生理鹽水管中，校正濃度至0.5麥氏標準(相當于1.0×108CFU/ml)［2］。

　　1.2.3  用無(wú)菌棉試蘸取菌液，在試管內壁旋轉擠去多余菌液后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60度，最后沿平板內緣涂抹1周。

　　1.2.4  平板在室溫下干燥3～5min后用無(wú)菌鑷子將GEN紙片緊貼于瓊脂表面，置35℃孵育。

　　1.2.5  于第4h，4.5h，5h，5.5h通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡放大160倍觀(guān)察，從GEN紙片邊緣開(kāi)始往外觀(guān)察，以視野由清晰、潔凈變?yōu)槟：齺?lái)判斷抑菌范圍，做出標記后量出抑菌圈直徑。第20h肉眼觀(guān)察量出抑菌圈直徑，本次實(shí)驗每種菌重復10次操作。

　1.2.6  統計學(xué)方法  使用F檢驗和Q檢驗。

　　2.1  ATCC25922第4h，4.5h，5h，5.5h，20h觀(guān)察量出抑菌圈直徑結果  見(jiàn)表1。

　　2.2  ATCC25923第4h，4.5h，5h，5.5h，20h觀(guān)察量出抑菌圈直徑結果  見(jiàn)表2。

　　表1  ATCC25922不同時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察抑菌直徑比較（略）

　　經(jīng)F檢驗發(fā)現有差異后進(jìn)行Q檢驗，對多個(gè)均數進(jìn)行兩兩比較如下：x1=21.26，x2=21.22，x3=21.16，x4=20.82，x5=20.42；Q1（1，2）=0.61，Q2（1，3）=1.54，Q3（1，4）=6.76，Q4（1，5）=12.91，Q5（2，3）=0.92，Q6（2，4）=6.15，Q7（2，5）=12.29，Q8（3，4）=5.22，Q9（3，5）=11.37，Q10（4，5）=6.15；P1>0.05，P2>0.05，P5>0.05，其余均<0.05。

　　表2  ATCC25923不同時(shí)間點(diǎn)觀(guān)察抑菌直徑比較（略）

　　經(jīng)F檢驗發(fā)現有差異后進(jìn)行Q檢驗，對多個(gè)均數進(jìn)行兩兩比較如下x1=22.77，x2=22.69，x3=22.64，x4=22.03，x5=21.42；Q1（1，2）=0.84，Q2（1，3）=1.37，Q3（1，4）=7.8，Q4（1，5）=14.24，Q5（2，3）=0.53，Q6（2，4）=6.96，Q7（2，5）=13.39，Q8（3，4）=6.43，Q9（3，5）=12.86，Q10（4，5）=6.43；P1>0.05，P2>0.05，P5>0.05，其余均<0.05。

根據細菌生長(cháng)曲線(xiàn)［3］，一般細菌的遲緩期是4h，遲緩期細菌生長(cháng)緩慢，對數期細菌生長(cháng)快，雖然第4h觀(guān)察時(shí)還是不能形成肉眼可以看得見(jiàn)的菌落或菌苔，但實(shí)際上已經(jīng)有不少的細菌開(kāi)始生長(cháng)，因此抓住遲緩期過(guò)后的30min或1h已經(jīng)有不少的細菌生長(cháng)的特點(diǎn)使用顯微鏡放大160倍觀(guān)察，可以比較清楚區分細菌生長(cháng)區和抑菌區。GEN紙片吸收水分，藥物逐漸擴散引起4～20h的抑菌圈直徑逐漸增大，其中4～5h期間抑菌圈直徑增大比較多，差異有顯著(zhù)性(P<0.05)，可能是紙片吸收水分不夠，藥物沒(méi)有完全釋放；5～20h抑菌圈直徑增加比較小，差異無(wú)顯著(zhù)性(P>0.05)，說(shuō)明紙片藥物已經(jīng)完全擴散。5h、5.5h、20h觀(guān)察的抑菌圈直徑比較P>0.05，說(shuō)明第5h觀(guān)察結果做出的初步診斷與第20h觀(guān)察的結果做出的最終診斷相同。ATCC25922與ATCC25923的初步診斷結果與最終診斷結果都相同。因此通過(guò)顯微鏡放大觀(guān)察可以把抑菌試驗縮短11h。影響抑菌實(shí)驗質(zhì)量的因素很多［4］，比如培養基的質(zhì)量、藥敏紙片的質(zhì)量、接種菌量、試驗操作質(zhì)量、孵育條件、抑菌圈測量工具的精度和質(zhì)控菌株本身的藥敏特性等均能影響紙片擴散法抗生素敏感試驗結果的準確性和精密度。這次實(shí)驗使用的GEN對ATCC25922、ATCC25923的質(zhì)控抑菌圈直徑范圍分別為19～26mm，19～27mm，而得出的實(shí)驗結果均符合質(zhì)控值范圍，說(shuō)明本次實(shí)驗是成功的。綜上所述，在條件比較簡(jiǎn)陋，沒(méi)有自動(dòng)檢測系統、分光光度計的儀器設備的檢驗機構通過(guò)顯微鏡放大觀(guān)察同樣可以進(jìn)行快速抑菌實(shí)驗，為臨床及時(shí)做出診治提供有力的幫助。

 

作者：黃衍強，李曉華，覃艷春，陳源紅，秦靜英  《右江民族醫學(xué)院學(xué)報》

  　�。�1］ 劉文娟，周櫻，錢(qián)厚明，等.VITEK-32微生物檢測系統工作原理及常見(jiàn)故障［J］.醫療裝備，2005，(10)：42-43.

　�。�2］ 徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗方法學(xué)［M］.北京：人民衛生出版社，2002.1651.

　�。�3］ 周正任，李凡.醫學(xué)微生物學(xué)［M］.北京：人民衛生出版社，2003.20.

［4］ 俞樹(shù)榮，陳拯，張卓然，等.微生物學(xué)與微生物學(xué)檢驗［M］.北京：人民衛生出版社，2001.455.