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病原菌與宿主的相互作用，是構成感染的基本因素�，F代分子生物學(xué)的發(fā)展推動(dòng)病原菌與宿主相互作用研究進(jìn)入到了分子水平。應用基因芯片轉錄組學(xué)分析技術(shù)，可以對病原菌入侵宿主以及宿主的防御抵抗進(jìn)行轉錄組學(xué)研究。從病原菌全基因組水平以及感染宿主的基因水平闡述病原菌與宿主之間的相互關(guān)系。闡明病原菌入侵以及宿主抵抗病原菌的分子機制，本文將對病原菌在感染宿主過(guò)程中的轉錄組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。
1 病原菌與宿主的相互作用
細菌性感染的發(fā)生和發(fā)展是病原菌與宿主相互作用的結果。感染的本質(zhì)是病原性細菌為達到在宿主內生存和繁殖的目的，與宿主的各種抵御因素發(fā)生相互作用。在此期間，既有病原菌為逃避宿主防御機制而進(jìn)行的適應，也有宿主為清除病原菌而調動(dòng)防御體系的努力。從細菌的角度講，由原寄生地侵襲到宿主時(shí)，環(huán)境中各種營(yíng)養物質(zhì)的含量、種類(lèi)、溫度、滲透壓與酸堿度等因素的改變，以及宿主對細菌的抵抗，必然對細菌的生存施加巨大壓力。為了生存，細菌能夠快速敏感地監測環(huán)境中各種因素的變化，迅速地調節本身的結構，調節其生理、生命行為，達到適應新的環(huán)境，在宿主體內寄生，感染宿主目的。對于宿主來(lái)說(shuō)，真核生物有著(zhù)極其完善的信號轉導系統，可以感知病原菌的侵入，啟動(dòng)嚴密的防御系統來(lái)抵抗病原菌的入侵。有些宿主還可以分泌一些殺菌素樣的物質(zhì)，導致病原菌不能在其體內生存，維持自身的正常生理狀態(tài)。病原菌與宿主相互作用研究一直是控制感染性疾病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節。
2 細菌的基因芯片轉錄組學(xué)研究
隨著(zhù)基因測序技術(shù)的發(fā)展與成熟，使得大量微生物基因組的序列測定完成。標志著(zhù)基因組學(xué)的研究由結構基因組學(xué)進(jìn)入了功能基因組學(xué)時(shí)期。轉錄組學(xué)研究是功能基因組學(xué)研究的一個(gè)重要手段。Velculescu和Kinzler等人于1997年首先提出轉錄組概念［1］。轉錄組學(xué)是從一個(gè)細胞中的基因組全部mRNA水平研究基因表達情況。轉錄組學(xué)研究作為一種宏觀(guān)的整體論方法改變了以往選定單個(gè)基因或少數幾個(gè)基因零打碎敲式的研究模式［2］，將基因組學(xué)研究帶入了一個(gè)全新的高速發(fā)展時(shí)代。
基因芯片轉錄組學(xué)研究是應用全基因組芯片對不同條件下細菌的mRNA進(jìn)行平行分析，可以獲得細菌在不同條件下所發(fā)生的差異變化基因，從基因水平上揭示基因表達的差異。該技術(shù)的反應原理是通過(guò)對不同來(lái)源的mRNA進(jìn)行逆轉錄，而后分別用不同顏色的熒光素標記成探針,探針混合后與芯片上的基因進(jìn)行雜交,再通過(guò)掃描儀掃描，獲得兩份樣品中RNA的相對豐度，結合已有生物信息學(xué)資源對數據進(jìn)行生物學(xué)解讀。
基因芯片技術(shù)的發(fā)展，為研究病原菌與宿主相互作用提供了全新的研究機會(huì )。通過(guò)基因芯片轉錄譜分析細菌感染宿主表達譜的差異，可以在全基因組范圍獲得細菌為適應在宿主體內生長(cháng)而表現的基因表達差異，通過(guò)對差異表達基因的生物信息學(xué)分析可以篩選到病原體在體內存活必需表達的基因，預測與致病性密切相關(guān)的毒力基因。從而有助于進(jìn)一步闡明致病菌的致病機制。芯片轉錄譜技術(shù)為大規模發(fā)現及鑒定病原菌致病基因提供了一個(gè)快速、有效的平臺。
3 病原菌與宿主相互作用體外轉錄組學(xué)研究進(jìn)展
應用轉錄譜芯片進(jìn)行病原菌與宿主相互作用研究經(jīng)歷了體外與體內兩個(gè)階段。首先是應用病原菌與感染宿主細胞在體外進(jìn)行相互作用，通過(guò)體外細胞來(lái)模擬病原菌感染宿主的微環(huán)境，獲得病原菌與宿主細胞之間的相互作用規律，從而間接反應病原菌入侵宿主的轉錄特征與分子作用機理。
目前對多種病原菌與多種體外細胞包括上皮細胞、內皮細胞接觸以及侵染多形核白細胞（PMNs）單核／巨噬細胞過(guò)程中基因表達變化進(jìn)行了體外轉錄組學(xué)研究。通過(guò)以上研究，發(fā)現了大量微生物的毒力相關(guān)基因，存活必須基因，以及在感染過(guò)程中細菌重要的酶類(lèi)和轉運蛋白相關(guān)基因等。闡述了病原菌在入侵宿主過(guò)程中的相關(guān)分子機理，為進(jìn)一步控制感染的發(fā)生奠定了理論基礎。
世界人口的一半以上感染有幽門(mén)螺桿菌。其中只有20%的感染者會(huì )表現出臨床癥狀。其原因可能在于感染不同類(lèi)型的幽門(mén)螺桿菌以及感染宿主的不同反應。在對幽門(mén)螺桿菌致病機理的研究中，芯片轉錄譜技術(shù)被廣泛應用。這些研究當中包括大量的幽門(mén)螺桿菌與胃上皮細胞共同作用后的轉錄譜研究［3～6］。例如Kim等通過(guò)對幽門(mén)螺桿菌與胃癌細胞AGS相互作用的研究結果表明［7］，在幽門(mén)螺桿菌與AGS細胞相互作用后，幽門(mén)螺桿菌毒力島相關(guān)基因，動(dòng)力相關(guān)基因，外膜蛋白相關(guān)基因發(fā)生了轉錄水平的上調。而在轉錄下調的基因當中包括壓力反應蛋白基因與過(guò)氧化物分解相關(guān)基因。研究結果表明上述基因在幽門(mén)螺桿菌粘附胃上皮細胞中發(fā)揮了重要作用，與其致病能力緊密相關(guān)。
2007年10月薛建江等：病原菌感染宿主的轉錄組學(xué)研究進(jìn)展第5期2007年10月河北北方學(xué)院學(xué)報（醫學(xué)版）第5期細菌性腦膜炎是兒童最常見(jiàn)的死亡病因，腦膜炎奈瑟氏菌為腦膜炎的病原菌。Dietrich等對該細菌在侵入機體中所遇到的兩個(gè)主要階段進(jìn)行了轉錄譜的研究［8］以獲得該病原菌在侵入機體以及適應機體的改變。通過(guò)對腦膜炎奈瑟氏菌與上皮細胞（Hela細胞）與內皮細胞（HBMEC人腦血管內皮細胞）相互作用而獲得該細菌和兩種細胞相互作用的轉錄譜，獲得了該細菌在感染不同階段所進(jìn)行的轉錄水平的不同變化，揭示了腦膜炎奈瑟菌在感染不同階段的分子致病機理。Schubert等人也對該菌進(jìn)行了類(lèi)似的轉錄譜研究［9］，表明在腦膜炎奈瑟菌與HBMEC相互作用中，該菌的莢膜起到了極為重要的作用。更進(jìn)一步揭示了腦膜炎奈瑟菌與宿主細胞在分子水平的相互作用。
4 病原菌與宿主相互作用體內轉錄組學(xué)研究進(jìn)展
在病原菌與感染宿主體內轉錄譜研究中，困擾所有微生物學(xué)工作者的一個(gè)重要問(wèn)題就是存在一些技術(shù)上的難題，這些技術(shù)上的難題限制了體內進(jìn)行病原與宿主相互作用的轉錄譜研究。這些技術(shù)上的難題主要包括原核生物mRNA的穩定性問(wèn)題，宿主細胞RNA的干擾，以及宿主細胞與感染細胞的難以分離�；蛐酒芯啃枰罅康�mRNA靶分子，大多數研究所用的mRNA是從大量細胞中提取出來(lái)的，然而，感染宿主組織中很難提供如此大量的感染細菌mRNA來(lái)進(jìn)行轉錄譜的研究。
對于上述問(wèn)題的存在，可以通過(guò)提高芯片檢測的靈敏度，開(kāi)發(fā)可重復有效擴增RNA靶分子的技術(shù)而使問(wèn)題得到解決。目前有兩種方法在擴增RNA靶分子方面顯示出一定優(yōu)勢。其一是利用PCR技術(shù)建立單細胞cDNA文庫，這種方法能夠有效且可重復的擴增mRNA分子，但是往往不能保證所得到的DNA文庫中的拷貝數與其在細胞中的拷貝數一致。其應用需通過(guò)應用統計方法對數據進(jìn)行歸一化處理［10］。另一種方法是應用DNA合成和模板指導下的體外轉錄反應來(lái)完成的RNA體外線(xiàn)性擴增［11］。通過(guò)體外擴增RNA可以將微量的mRNA在體外進(jìn)行放大，從而可以滿(mǎn)足芯片檢測需要。與構建文庫的方法相比，這種擴增方法更具線(xiàn)性，更能反應真實(shí)情況。該研究方法的出現，可以為解決在研究病原與宿主相互作用的轉錄譜研究中RNA量的問(wèn)題。相信隨著(zhù)該項技術(shù)的逐步完善，體內轉錄譜的研究將會(huì )更為廣泛的開(kāi)展。
Lathem等人應用RNA線(xiàn)性擴增技術(shù)對造成小鼠實(shí)驗性肺鼠疫中感染48h的鼠疫菌進(jìn)行了擴增［12］。該研究使用裂解液成功的將鼠疫細菌與肺組織細胞進(jìn)行了分離，對分離到的RNA進(jìn)行了擴增，進(jìn)行了鼠疫菌造成肺鼠疫轉錄譜研究。研究結果表明，與鼠疫菌致病相關(guān)的主要毒力因子在體內感染多數表現為高表達。例如T3SS中的基因，鐵攝入以及鐵貯存的相關(guān)基因，通過(guò)芯片轉錄譜研究對鼠疫菌引起宿主感染的分子致病機理進(jìn)行了闡述。
霍亂是以嚴重腹瀉為主要癥狀的感染性疾病，其病原菌為霍亂弧菌。已經(jīng)完成該菌的全基因組序列表明，其全基因組包含大小兩個(gè)片段。大片段編碼了霍亂弧菌大部分的基因，而小片段的基因功能則很少了解。Xu等應用芯片轉錄譜技術(shù)對分布于不同片段的基因進(jìn)行了感染家兔體內轉錄譜的研究［13］，一方面，通過(guò)研究了解該細菌在感染宿主體內的基因轉錄情況，另一方面的目的是揭示小片段的基因組在感染過(guò)程中的功能。研究者通過(guò)創(chuàng )造性的將家兔小腸進(jìn)行結扎，從而形成小腸結扎環(huán)模型，將霍亂弧菌注入結扎環(huán)內，感染一定時(shí)間后將細菌從結扎環(huán)內進(jìn)行收集，收集RNA后與體外營(yíng)養環(huán)境中培養的細菌進(jìn)行比較，從而獲得了霍亂弧菌體內感染的轉錄譜。研究結果表明，在發(fā)生轉錄明顯改變的基因中大部分為大片段染色體基因。揭示了在感染家兔小腸體內該細菌的一些高轉錄基因包括與動(dòng)力化學(xué)趨向性相關(guān)的一些基因，以及與腸內定值相關(guān)的一些基因以及與毒素產(chǎn)生相關(guān)的基因。對霍亂弧菌的分子致病機理進(jìn)行了闡述。
空腸彎曲菌是引起腹瀉的主要病原菌。該菌在小腸內成功的粘附與定植是構成其致病力的關(guān)鍵因素。Stintzi等人同樣應用小腸結扎環(huán)的方法對空腸彎曲菌進(jìn)行了感染新西蘭白兔小腸的研究［14］。通過(guò)對該菌在小腸內生存所進(jìn)行的轉錄譜研究，獲得了大量與其在腸內生存相關(guān)的基因，對其致病機理進(jìn)行了分子水平的研究。
Snyder等人應用芯片轉錄譜技術(shù)對引起泌尿感染的致病性大腸埃希氏菌進(jìn)行了體內轉錄譜的研究［15］。該研究將從感染小鼠的尿液中直接提取細菌RNA，得到了該細菌在感染宿主體內的多個(gè)毒力與代謝因子。在與泌尿系感染相關(guān)的基因當中，有這樣一些基因高表達。菌毛基因相關(guān)的莢膜形成，微生物素分泌，鐵攝入相關(guān)基因轉錄水平明顯上調，表明這些基因與大腸桿菌的致病性密切相關(guān)。
在對感染細菌與宿主相互作用研究中，不同的研究者應用了不同的方法進(jìn)行了研究。例如通過(guò)對無(wú)菌部位的液體標本直接進(jìn)行分離來(lái)獲得研究所需要的細菌量，Orihuela對感染小鼠血液中細菌采用離心的方法進(jìn)行分離［16］，通過(guò)差速離心的方法將感染小鼠血液中的肺炎球菌與血細胞進(jìn)行了分離，進(jìn)行了肺炎球菌感染小鼠體內的轉錄譜研究，獲得了該細菌感染體內的特征性轉錄譜，對其致病機理進(jìn)行了研究。Talaat等則應用全基因組引物GDP對感染組織內未進(jìn)行細菌與細胞分離的結核分枝桿菌直接進(jìn)行逆轉錄［17］，獲得了感染體內結核分枝桿菌的轉錄譜，對結核分枝桿菌的分子致病機理進(jìn)行了研究。Merrell等應用直接分離的方法對霍亂病人的米泔樣糞便中的霍亂弧菌進(jìn)行了分離并進(jìn)行了轉錄譜研究［18］。Graham等應用全基因組芯片對引起化膿性感染的A族鏈球菌M1株進(jìn)行了感染小鼠上皮組織的轉錄譜研究［19］，解釋了在形成化膿性感染過(guò)程中參與的主要基因功能類(lèi)群，包括毒力基因、氧化壓力基因、氨基酸利用、二元調控系統等基因在皮膚軟組織感染中的作用。對A族鏈球菌引起的化膿性感染的分子機理進(jìn)行了闡述。Roos等人則通過(guò)收集患者尿液中大腸埃希菌83792株直接與體外培養的相同細菌進(jìn)行了轉錄譜研究［20］。指出在該菌株致病過(guò)程中NO代謝相關(guān)基因具有非常重要的意義。同樣是對尿液中的大腸埃希菌83792株，Hancock等人則進(jìn)行了該菌在體內與生物膜形成的相關(guān)分子機制研究［21］，揭示了該菌在形成致病中生物膜所起的作用以及與生物膜形成的相關(guān)基因。更進(jìn)一步的闡述了大腸埃希菌83792株導致泌尿系感染的分子致病機理。
5 結論
基因芯片轉錄譜技術(shù)在研究細菌與宿主相互作用中展示了其應用優(yōu)勢,極大地推動(dòng)了相關(guān)研究的發(fā)展。結合原核生物基因組序列資料，通過(guò)芯片轉錄譜研究可以在基因水平描繪細菌如何適應宿主環(huán)境，以及為適應宿主環(huán)境所作出的基因改變。揭示細菌與環(huán)境相互作用的代謝途徑、細菌的致病毒力因子以及病原菌的分子致病機制。從而為進(jìn)一步控制細菌性感染的發(fā)生奠定理論基礎。
作者：薛建江 邱景富 《河北北方學(xué)院學(xué)報》
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