大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌整合子分布與ESBLs耐藥基因的研究

【摘要】  目的 研究產(chǎn)超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)菌株整合子分布以及在ESBLs基因水平轉移中的作用。方法 采用PCR方法檢測產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的整合酶基因,分析整合子在產(chǎn)TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布及經(jīng)質(zhì)粒轉移的情況。結果 產(chǎn)ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32. 9%；產(chǎn)ESBLs菌同時(shí)具有≥1種的ESBLs基因, bla SHV+ CTX基因檢出率為12.9%、blaCTX+TEM為9.8%、 blaSHV +TEM為8.7% 和 blaSHV+ CTX+ TEM為5.2%。結論產(chǎn)ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因與整合子具明顯相關(guān)性；整合子攜帶著(zhù)1個(gè)以上的多個(gè)耐藥基因盒,與宿主菌的多重耐藥性密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  耐藥基因 超廣譜β內酰胺酶整合子

    【Abstract】  Objective  To study the distribution of class Ⅰintegron in extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs)-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and its contribution in horizontal transfer of ESBLs genes.Methods  The presence of class Ⅰintegron among ESBLs-producers and non-ESBLs-producers of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were detected by polymer asechain reaction(PCR).The correlation and co-transfer between integron and genes coding for SHV, CTX and TEM were studied.Results  The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was 58.2%、74.7%、32. 9% respectively; bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM and blaSHV+ CTX+ TEM was 12.9%、9.8%、8. 7%、5.2% respectively. Conclusion  The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was related with class Ⅰintegron;The integron with antibiotic resistance gene cassette contributes to multidrug resistance in ESBLs-producing strains.

    【Key words】  antibiotic resistant gene; ESBLs; integron

    ESBLs是導致革蘭陰性菌對β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥的重要機制。質(zhì)粒、轉座子和整合子對耐藥基因在細菌間的水平轉移起著(zhù)重要作用。整合子可特異性地俘獲和表達外源基因盒,并以質(zhì)�；蜣D座子為載體在細菌間移動(dòng),導致耐藥基因的快速和廣泛播散。整合子可攜帶對氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺等耐藥基因盒。整合子大致可分為Ⅳ類(lèi),其中Ⅰ類(lèi)在捕獲和表達耐藥基因中最常見(jiàn)。因此本文通過(guò)研究產(chǎn)ESBLs菌株中Ⅰ類(lèi)整合子的分布和性質(zhì),明確菌株的播散趨勢,有效監控細菌耐藥。由于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌是臨床最常見(jiàn)的產(chǎn)ESBLs菌,其中CTX-M、SHV和TEM是最常見(jiàn)的ESBLs型別，本文對我院2006年肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的臨床分離株,檢測Ⅰ類(lèi)整合子在產(chǎn)TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布,明確Ⅰ類(lèi)整合子在產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的流行和播散中的臨床意義。

　　1  材料與方法

    1.1  菌株來(lái)源  281株肺炎克雷伯菌和201株大腸埃希菌均為我院臨床標本中分離并按全國統一操作規程［1］。標本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。

    1.2  儀器試劑  VITEK-2型全自動(dòng)微生物分析儀、ID-GN 鑒定卡、AST-GN09藥敏卡由法國Bio-Merieux公司生產(chǎn); VITEK 比濁計(V 1210) 由日本生產(chǎn)；PCR擴增儀為美國PERKIN ELMER公司9600型基因擴增儀；日本三洋MDF型超低溫冰箱;德國Hettich公司22R型低溫超速離心機;美國水套式恒溫培養箱。

    1.3  菌種鑒定、藥敏  所有實(shí)驗菌株分離純化后按VITEK-2的使用要求配制成菌懸液和稀釋液, 分別填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2儀器自動(dòng)完成細菌的鑒定和藥敏試驗。

    1.4  質(zhì)控菌株  由衛生部臨床檢驗中心提供的標準菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853) , 藥敏質(zhì)控結果符合NCCLS 藥敏質(zhì)控要求。

    1．5  超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）檢測  按照NCCLS 2000年版推薦的紙片擴散表型確證法進(jìn)行檢測。用肺炎克雷伯菌 ATCC700603為陽(yáng)性對照，大腸埃希菌 ATCC2592為陰性對照。

    1.6  耐藥基因的檢測  采用堿裂解法和蛋白酶K法提取被測細菌的質(zhì)粒和染色體基因,提取方法根據不同引物設立不同PCR條件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大腸埃希菌分別作SHV型和TEM型陽(yáng)性對照。

    1．7  質(zhì)粒接合轉移  將產(chǎn)ESBLs菌株和大腸埃希菌培養到對數生長(cháng)期,按6：1（v/v）接種,37℃培養,用含頭孢噻肟(1μg/ml)的培養基篩選接合菌,制備模板用于PCR擴增。

    1.8  PCR耐藥菌基因［2］  根據GenBank公布的Ⅰ類(lèi)整合子整合酶基因和blaSHV、blaCTX和blaTEM基因序列，采用Primer軟件設計引物(表1)。反應體系均為25μl,其中緩沖液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超純水18.75μl 。根據不同引物設立不同PCR反應條件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型陽(yáng)性對照，以TEM-26型大腸埃希菌作TEM型陽(yáng)性對照,產(chǎn)物經(jīng)電泳,在紫外線(xiàn)下觀(guān)察結果,并在凝膠上成像。

    1.9  DNA序列分析［3］  PCR擴增的基因片段經(jīng)電泳后,切下相應條帶純化,進(jìn)行DNA測序,結果在GenBank序列數據庫進(jìn)行同源性分析(BLASTN)。

    1．10  統計學(xué)處理［2］  細菌耐藥性分析用 WHONET5軟件進(jìn)行分析，耐藥率差異有顯著(zhù)性，用SPSS10.0統計軟件分析,兩組耐藥率比較應用χ2檢。表1  用于檢測耐藥基因的引物

    2  結果與分析

    2．1  ESBLs檢出結果及耐藥率  281株肺炎克雷伯菌和201株大腸埃希菌共檢出ESBLs 194株，占40.３%,非產(chǎn)ESBLs細菌為288株占59.7%。產(chǎn)ESBLs 的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對抗生素的平均耐藥率為74.1%,明顯較非產(chǎn)ESBLs株平均耐藥率47.9%高(P<0.05)。產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌除頭孢替坦外，對其他頭孢類(lèi)抗生素的耐藥率均在90%以上；對β內酰胺和碳青霉烯類(lèi)如氨芐西林、氨曲南和哌拉西林的耐藥率為100%，僅對美洛培南和亞胺培南二種抗生素未產(chǎn)生耐藥；產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株(P<0.05)(表2)。表2  產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌對抗生素的耐藥率

    2．2  產(chǎn)ESBLs菌株的PCR檢測  對13株產(chǎn)ESBLs菌株(其中8株大腸埃希菌和5株肺炎克雷伯菌)的PCR產(chǎn)物測序，其中blaTEM陽(yáng)性的擴增產(chǎn)物為TEM-1基因, blaCTX陽(yáng)性的擴增產(chǎn)物為CTX-M-3基因,而blaSHV陽(yáng)性的擴增產(chǎn)物則分別為SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12。blaTEM、blaCTX和blaSHV基因的PCR瓊脂凝膠電泳如圖1～3。圖1  TEM基因PCR擴增電泳圖圖2  SHV基因PCR擴增電泳圖(1： DNA分子量標志,2000bp梯帶；

2:陰性對照；3～5:臨床菌株。)

    圖3  CTX基因PCR擴增電泳圖

    2.3  blaTEM、blaCTX和blaSHV的基因檢測結果  產(chǎn)ESBLs菌株的blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32. 9%，產(chǎn)ESBLs菌同時(shí)具有≥1種的ESBLs基因如bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM 和 blaSHV+ CTX+ TEM基因檢出率分別為12.9%、9.8%、8.7%和5.2%。其中93株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中, blaTEM基因檢出率為81.7% (76/93), blaCTX基因檢出率為94.6% (88/93), blaSHV基因檢出率14.0% (13/93)，blaSHV+ CTX基因檢出率12.9% (12/93)， bla CTX+ TEM基因檢出率8.6% (8/93)，blaSHV +TEM基因檢出率9.7% (9/93), blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因檢出率4.3% (4/93)。101株產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中, blaTEM基因檢出率為36.7% (37/101), blaCTX基因檢出率為56.4% (57/101), blaSHV基因檢出率為50. 5% (51/101), blaSHV+ CTX基因檢出率12.9% (13/101)， bla CTX+ TEM基因檢出率10.9% (11/101)，blaSHV +TEM基因檢出率7.9% (8/101), blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因檢出率5.9 % (6/101)(表3)。

    2．4  產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性和陰性整合子對抗菌藥物的耐藥率  兩組對頭孢類(lèi)抗生素如頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率均>90%，經(jīng)χ2檢驗P>0.05差異無(wú)顯著(zhù)性，而產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性對頭孢噻肟和頭孢唑啉的耐藥率也均>90%，但與整合子陰性的產(chǎn)ESBLs菌株比較P<0.05，差異有顯著(zhù)性。產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性整合子對其他抗生素如氨芐西林和哌拉西林的耐藥率均高于整合子陰性產(chǎn)ESBLs菌株,經(jīng)χ2檢驗,差異有顯著(zhù)性(P<0.05)。兩組對亞胺培南和美洛培南的耐藥率均很低（表4）。表3  3種基因型PCR產(chǎn)物在產(chǎn)ESBLs菌株中的分布表4  產(chǎn)ESBLs菌株陽(yáng)性和陰性整合子對抗菌藥物的耐藥率

    3  討論

    大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，常寄殖于人體上呼吸道和腸道，是重要的條件致病菌和院內感染常見(jiàn)的病原體之一［4］。ESBLs主要在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現。本文ESBLs從大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的檢出率為40.3%。產(chǎn)ESBLs菌對常用抗生素的平均耐藥率高達74.0%,對氨芐西林、環(huán)丙沙星、一二三代頭孢菌素均具有很高的耐藥率，產(chǎn)生了明顯的多重耐藥［5］。

    由于ESBLs是質(zhì)粒介導，可通過(guò)轉化、轉導、接合轉移等方式傳遞而造成耐藥菌流行。質(zhì)粒、轉座子和整合子對耐藥基因在細菌間的水平轉移起著(zhù)重要作用［5，6］。本文用PCR檢測產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中Ⅰ類(lèi)整合子的分布,結果顯示blaTEM陽(yáng)性的壙增產(chǎn)物為TEM-1基因, blaCTX陽(yáng)性的擴增產(chǎn)物為CTX -3基因,而blaSHV陽(yáng)性的擴增產(chǎn)物則分別為SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12基因。blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32. 9%，說(shuō)明產(chǎn)ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因與整合子具明顯相關(guān)性，但三者經(jīng)質(zhì)粒與整合子共同轉移的頻率不同。其中blaCTX的轉移率最高,達到74.7%,其次為blaTEM（ 58.2%），blaSHV的轉移率最低。提示本文中產(chǎn)ESBLs臨床分離株中的blaCTX與整合子緊密相關(guān)。推測blaCTX可能位于整合子中或者與整合子位于同一個(gè)接合性質(zhì)粒的遺傳元件上，可能是ESBLs菌株遺傳元件的主要流行方式。

本文71株產(chǎn)ESBLs菌同時(shí)具有≥1種的ESBLs基因,其中bla SHV+ CTX基因檢出率為12.9%、blaCTX+ TEM為9.8%、 blaSHV +TEM為8.7%和blaSHV+ CTX+ TEM為5.2%。說(shuō)明整合子攜帶著(zhù)1個(gè)以上的多個(gè)耐藥基因盒,與宿主菌的多重耐藥性密切相關(guān)。這可能揭示了本文中產(chǎn)ESBLs臨床分離株對頭孢類(lèi)、β-內酰胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素多重耐藥的發(fā)生和轉移機制［7］。也是導致整合子陽(yáng)性株對三代和四代頭孢菌素高耐藥率的重要原因。

作者：徐琳

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