肺炎鏈球菌感染及耐藥機制研究的新探討

　【論文摘要】肺炎鏈球菌存在于人的喉部和鼻子的后部,大約40%的人平時(shí)就攜帶這種病菌,能引發(fā)肺炎、菌血癥和腦膜炎,對人類(lèi)的健康構成了一定的威脅,每年導致300萬(wàn)兒童死亡。

　　肺炎鏈球菌存在于人的喉部和鼻子的后部，大約40%的人平時(shí)就攜帶這種病菌，能引發(fā)肺炎、菌血癥和腦膜炎，對人類(lèi)的健康構成了一定的威脅，每年導致300萬(wàn)兒童死亡。更為嚴重的是，在過(guò)去用青霉素就可以殺死的肺炎鏈球菌，現在抵抗抗生素的能力越來(lái)越強�？茖W(xué)家則希望通過(guò)對肺炎鏈球菌的基因測序，更好地認識這種細菌并開(kāi)發(fā)出新的抗生素。近年來(lái)肺炎鏈球菌對抗生素耐藥性呈上升趨勢，并已出現多重耐藥菌株，是臨床感染控制中非常棘手的難題。

　　1耐藥性的流行概況

　　在美國，上世紀80年代肺炎鏈球菌總的青霉素耐藥率不到5%，而且均為低水平耐藥（中介），到90年代初，總的青霉素耐藥率迅速上升到17%，目前已經(jīng)超過(guò)30%。Gordon等在1997年-2001年研究表明肺炎鏈球菌中耐青霉素的肺炎鏈球菌（PRSP）檢出率為16.7%，對復方磺胺甲唑的耐藥率（R%）是25.0%。1997年-2000年，我國文獻報道的肺炎鏈球菌耐藥率（R+I）還僅在8.8%~22.5%之間，但在最近的調查中，肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥率（R+I）已高達42.7%，顯示出快速上升的勢頭。還有一些最新調查顯示，肺炎鏈球菌對紅霉素的耐藥率超過(guò)了70%。目前，對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌的數量報道不一，與地區分布有關(guān)[1、2]。廣譜頭孢菌素（如頭孢曲松、頭孢氨噻）已成功用于青霉素耐藥的肺炎鏈球菌引起的嚴重感染，但對這些因子的抗藥性也似乎有所增加。肺炎鏈球菌已對多種抗菌藥物產(chǎn)生廣泛耐藥，包括β內酰胺類(lèi)、大環(huán)內酯類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)。肺炎鏈球菌對抗生素的耐藥率在逐年增長(cháng)，其中尤以青霉素和紅霉素最受人們關(guān)注。

　　2影響耐藥性的相關(guān)因素

　　耐青霉素G肺炎鏈球菌（PRSP）分離率近年來(lái)已在世界范圍明顯上升，特別是某些歐洲國家，美國一些地區，東南亞的某些國家地區PRSP已高達40%~50%[3、4]。肺炎鏈球菌對青霉素耐藥最早發(fā)現于上世紀60年代中期，但引起人們注意的是在1977年在南非首次發(fā)生青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP）引起的肺炎暴發(fā)流行[5]。以后世界各地都不斷分離出PRSP，并使其成為耐藥陽(yáng)性球菌感染中引人注目的焦點(diǎn)之一。肺炎鏈球菌的血清型與青霉素的耐藥性存在著(zhù)一定關(guān)系，見(jiàn)表1。PRSP分離率上升與β內酰胺類(lèi)抗生素如頭孢菌素、非β內酰胺類(lèi)抗生素如大環(huán)內酯類(lèi)等抗生素大量使用及某些治療方案不合理有很大關(guān)系。非β內酰胺類(lèi)抗生素大環(huán)內酯類(lèi)在臨床上治療呼吸道感染用得非常廣泛，對誘導肺炎鏈球菌的耐藥性也起著(zhù)很大作用。如臺灣省[6]用大環(huán)內酯類(lèi)作為治療呼吸道感染的一線(xiàn)藥物導致所分離的PRSP對大環(huán)內酯類(lèi)的耐藥率高達98%。

　　3耐藥性的發(fā)生機制

　　肺炎鏈球菌對青霉素與其他β內酰胺類(lèi)抗生素的耐藥機制主要是青霉素結合蛋白PBPS的改變。肺炎鏈球菌有6個(gè)PBPS，分子量43~100 kDa，PBP-la與PBP-lb分子量均為100 kDa，PBP-2a（89.4 kDa），PBP-2x（82 kDa），PBP-2b（78 kDa），PBP-3（43 kDa）。敏感肺炎鏈球菌的PBP-la/lb、PBP-2a/2x/2b都很容易被β內酰胺類(lèi)抗生素結合而殺菌。肺炎鏈球菌耐藥株P(guān)BP-la，2x，2a與2b這4個(gè)分子量較大的PBPS則與青霉素的親和力明顯降低。編碼表達這幾個(gè)PBP蛋白的基因為pbpla，pbp2x和pbp2b，這些耐藥基因可在同種肺炎鏈球菌之間轉移，橫向轉移，如由肺炎鏈球菌把耐藥基因轉移至草綠色鏈球菌，則pbp2b基因起著(zhù)重要的作用。pbpla，pbp2x這兩個(gè)基因都在體外一步法證明可把肺炎鏈球菌對超廣譜頭孢霉素的耐藥性轉移到敏感菌株中去。肺炎鏈球菌對青霉素耐藥的作用過(guò)程包含了PBPS蛋白一系列變異。在一些青霉素耐藥的菌株中的PBPS的結構有所改變，與β內酰胺類(lèi)抗生素的親和性降低，從而降低了對抗生素的敏感性。另外研究發(fā)現肺炎鏈球菌PBPS基因突變，可引起相對低水平耐藥（在腦膜炎的治療中可采用大劑量治療）。人們發(fā)現β內酰胺類(lèi)抗生素對肺炎鏈球菌的作用有兩種方式：一種是以哌拉西林為代表的裂菌式；另一種是以頭孢氨噻為代表的作用方式，這些頭孢菌素類(lèi)抗生素殺菌并不溶菌，這表明β內酰胺類(lèi)抗生素作用于肺炎鏈球菌存在一些非PBPS相關(guān)的作用機制。目前人們已經(jīng)發(fā)現了一些非PBPS的耐藥相關(guān)基因，但并不清楚它們的作用機制。值得注意的是，這些與非PBPS基因相關(guān)的肺炎鏈球菌耐藥菌株都是感受態(tài)缺陷菌株，提示細菌的感受態(tài)可能與非PBPS途徑的耐藥機制相關(guān)。感受態(tài)是肺炎鏈球菌在其生長(cháng)的某一階段自然形成的一種狀態(tài)[7]，它可以攝取周?chē)�裸露的DNA片段。這類(lèi)似人們熟悉的在實(shí)驗室制備大腸桿菌的感受態(tài)，不同的是大腸桿菌不能自然形成此狀態(tài)。肺炎鏈球菌的感受態(tài)是由一個(gè)叫作感受態(tài)刺激因子的17肽誘導形成的。最早發(fā)現的一個(gè)非PBPS的耐藥基因是ciaH，為一種組氨酸蛋白激酶。人們發(fā)現在頭孢噻肟耐藥的肺炎鏈球菌中，有3株感受態(tài)缺陷菌株的PBPS沒(méi)有異常改變，而發(fā)現ciaH的基因有變化。轉化變異的ciaH到抗生素敏感的肺炎鏈球菌中，轉化細菌同樣程度耐藥，提示細菌的耐藥與ciaH的變異相關(guān)。另一研究則發(fā)現在哌拉西林耐藥菌株中存在另一個(gè)基因cpoA的變化，這些菌株同樣是感受態(tài)缺陷菌株。研究發(fā)現，與ciaH不同，cpoA的變異體仍有一定的感受態(tài)誘導活性，只是在較晚的時(shí)候發(fā)生。與非PBPS相關(guān)變異的耐藥基因都與細菌的感受態(tài)相關(guān)，這提示肺炎鏈球菌的感受態(tài)可能影響了它們的表達，但目前的研究都只限于已發(fā)現的兩種基因ciaH和cpoA對細菌感受態(tài)的影響，并沒(méi)有研究感受態(tài)是否影響它們的表達。對頭孢氨噻和哌拉西林的最低抑菌濃度監測的實(shí)驗結果表明，野生菌株與其感受態(tài)缺陷菌株的MIC值的確有差異。提示感受態(tài)缺陷可影響菌株對β內酰胺類(lèi)抗生素的敏感性，但對不同菌株的影響結果卻不盡相同。目前所知的非PBPS類(lèi)耐藥基因只有ciaH和cpoA基因，而它們都與感受態(tài)相關(guān)。研究認為ciaH系統控制了細菌脂質(zhì)轉運的水平，因而該系統對胞壁質(zhì)的合成有一定的調控作用。一些學(xué)者認為ciaH變異可能導致自身的異常激活，從而刺激細菌萜醇的合成，使脂質(zhì)聯(lián)結的胞壁質(zhì)前體水平升高，增加了胞壁質(zhì)的合成。而β內酰胺類(lèi)抗生素可能誘導變異的ciaH活化，產(chǎn)生上述反應，以抵消細胞壁的損傷，使細菌表現出耐藥性增高。

美國研究人員發(fā)現，在1994年到1999年間，對大環(huán)內酯類(lèi)耐藥的肺炎球菌增加了3倍。為了確定肺炎球菌對大環(huán)內酯類(lèi)耐藥的機制，研究人員在亞特蘭大對4 148個(gè)肺炎球菌的分離株進(jìn)行了長(cháng)達6年的血清定型和藥敏試驗。他們指出大環(huán)內酯耐藥菌株的比例從1994年的16%增加到1999年的32%。研究人員發(fā)現，99%的大環(huán)內酯耐藥菌株存在mefE或核糖體甲基化酶基因ermAM。在6年的監測中，ermAM血清型在細菌分離株出現率比較穩定，而mefE的出現率從1994年的9%增加到1999年的26%。到1999年，紅霉素對93%帶有mefE基因離株的最大抑制濃度增大到8 mg/ml。近年來(lái)的研究表明，肺炎鏈球菌對大環(huán)內酯類(lèi)抗生素耐藥的機制涉及到多個(gè)方面，靶位改變由耐藥基因erm變?yōu)閙ls型耐藥。根據表達方式的不同，又分為cMLS內在型耐藥和iMLS誘導型耐藥。在肺炎鏈球菌中的elm基因絕大多數為ermB基因，少數由ermTR基因介導。我國以ermB基因介導的內在型耐藥為主，對紅霉素的耐藥水平較高，對林可霉素類(lèi)和鏈陽(yáng)菌素B呈交叉耐藥。我國有研究顯示，148株紅霉素耐藥株中，耐藥基因以ermB基因（79.1%）介導為主；耐藥表型以MLS型耐藥（89.2%）為主，其中cMLS占85.1%，iMLS占4.1%，為檢測到ermTR基因。ermB基因被轉座子攜帶，例如Tn917和Tn1545。在對日本人84株肺炎鏈球菌的研究顯示出對大環(huán)內酯類(lèi)耐藥與Tn917或Tn1545攜帶的erm基因有關(guān)。大環(huán)內酯類(lèi)耐藥株被分成以下2組：第1組（19株）顯示對紅霉素有高度耐藥性，但是對羅奇達敏感，是由于Tn1545上ermB基因的存在。第2組（65株）顯示對這兩種抗生素均有高度耐藥性，也是由于Tn917上ermB基因的存在。2組中沒(méi)有一株對大環(huán)內酯類(lèi)持續耐藥，第2組中菌株的ermB基因促進(jìn)區都有一個(gè)缺失并且在主要肽鍵上還有TAAA插入子。脈沖凝膠電泳和血清學(xué)分型顯示Tn1545是克隆擴散而Tn917是水平性克隆性擴散，得出的結論是，日本肺炎鏈球菌大環(huán)內酯類(lèi)耐藥株主要是ermB基因被Tn917攜帶擴散。

　　在許多歐洲國家，肺炎鏈球菌對大環(huán)內酯類(lèi)的耐藥水平已經(jīng)超過(guò)對青霉素G的耐藥水平。國外學(xué)者認為，大環(huán)內酯類(lèi)抗生素的廣泛應用可能是紅霉素耐藥增加的主要原因，回顧過(guò)去19年大環(huán)內酯類(lèi)抗生素的使用和肺炎鏈球菌的耐藥情況顯示：紅霉素的耐藥與大環(huán)內酯類(lèi)藥物的消耗有很高的相關(guān)性，而紅霉素的不同耐藥機制與不同類(lèi)型大環(huán)內酯類(lèi)抗生素的應用并無(wú)關(guān)聯(lián)。其不同耐藥機制的地區差異是否與多藥耐藥株的克隆傳播有關(guān)，需進(jìn)一步研究。還有學(xué)者報道，攜帶ermB基因的肺炎鏈球菌對紅霉素的MIC值多大于32μg/ml，而攜帶mefA基因的肺炎鏈球菌MIC值多小于32μg/ml。根據不同耐藥與紅霉素耐藥高低的關(guān)系，有學(xué)者提出，克拉霉素、阿奇霉素因其特殊的藥代動(dòng)力學(xué)，在組織和感染部位的濃度較高，故治療攜帶mefA基因的耐紅霉素肺炎鏈球菌應有效，但目前尚無(wú)動(dòng)物實(shí)驗或臨床試驗證實(shí)，仍需進(jìn)一步研究。

　　肺炎鏈球菌對頭孢菌素耐藥的機制為：肺炎鏈球菌與其他耐藥菌（如草綠色鏈球菌和其他肺炎鏈球菌）的脫氧核糖核酸結合后導致西林結合蛋白編碼的基因改變，產(chǎn)生的西林結合蛋白可減弱肺炎鏈球菌對β內酰胺類(lèi)抗生素的親和力耐藥。從臨床標本中分離出的92株肺炎鏈球菌進(jìn)行了藥敏試驗，結果青霉素耐藥株占25%，頭孢菌素、四環(huán)素和氯霉素隨青霉素的MIC升高而對肺炎鏈球菌的敏感性下降。青霉素敏感株的6%、中度耐藥株的57%和高度耐藥株的100%對1種以上的其他抗生素耐藥。全部菌株對萬(wàn)古霉素敏感。12株多種抗生素耐藥者均對青霉素中度以上耐藥。所以萬(wàn)古霉素是治療青霉素耐藥肺炎鏈球菌感染的首選抗生素。另外，在肺炎鏈球菌對喹諾酮類(lèi)耐藥性研究中發(fā)現，在分離的81株左旋氧氟沙星耐藥株中78株（96.3%）經(jīng)分析有多數喹啉耐藥決定區gyrA、gyrB、parC和pare基因突變。對喹諾酮類(lèi)的耐藥機制為：DNA回旋酶變異和藥物排出。前者由gyrA、gyrB、parC和pare基因介導，后者由pmrA基因介導。根據大批量流行病學(xué)調查研究，應用分子技術(shù)顯示鏈球菌抗生素耐藥性擴散是克隆性擴散。

我國的研究還發(fā)現，無(wú)論是兒童還是成年人分離的肺炎鏈球菌，對青霉素、紅霉素耐藥均呈迅速上升趨勢，通過(guò)對新生兒呼吸道的20株對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌與青霉素耐藥相關(guān)的青霉素結合蛋白2編碼序列pbp2B基因，與紅霉素耐藥相關(guān)erm，mefA基因進(jìn)行了檢測與分析，發(fā)現20株新生兒臨床分離的肺炎鏈球菌苯唑西林表型耐藥率達100%，均有pbp2B基因突變。獲得erm基因的細菌可同時(shí)對大環(huán)內酯類(lèi)-林可霉素-鏈陽(yáng)菌素B耐藥，細菌也可因獲得mef基因表達主動(dòng)外排轉運使紅霉素從細菌內向外排出而耐藥，此機制僅耐紅霉素。20株耐青霉素的肺炎鏈球菌對紅霉素的耐藥率達85%，均檢出mefA/B，17株檢出mefA基因。這項研究提示一線(xiàn)藥物已不能完全控制該地區的肺炎鏈球菌感染。

作者：朱兆生　姚磊 《基層醫學(xué)論壇》

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