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【摘要】 針對環(huán)境中的壓力，細菌會(huì )采取不同的響應以維持自身的穩定。某些抗生素能夠誘導肺炎鏈球菌轉變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞，提高細胞轉化率，從而產(chǎn)生更適宜生存的耐藥突變株。本文根據近年來(lái)有關(guān)感受態(tài)的研究，重點(diǎn)闡述肺炎鏈球菌中抗生素誘導的感受態(tài)與耐藥性之間的關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】 肺炎鏈球菌； 抗生素； 感受態(tài)； 轉化； 耐藥性
Antibiotic stress induced competence and the drug
ABSTRACT Bacteria took different general responses to stress conditions for survival. In response to antibiotic stress, Streptococcus pneumoniae used competence as a fitnessenhancing strategy. Transformation contributed the genetic plasticity and played a central role in the pathogen adaptive resistance to the antibiotic therapy. This review focused on the relationship between competence and bacterial antibiotic resistance.
KEY WORDS Streptococcus pneumoniae; Antibiotics; Competence; Transformation; Resistance
1 經(jīng)典理論中細菌耐藥性和抗生素壓力
青霉素的發(fā)現和使用，開(kāi)啟了抗菌治療史上偉大的篇章�？股貙τ谌祟�(lèi)的健康事業(yè)功不可沒(méi)，但短短幾十年過(guò)后MRSA、VRE及其它耐藥菌的相繼出現，使這些曾經(jīng)風(fēng)光的抗生素陷入了兩難的境地。關(guān)于耐藥菌的出現，經(jīng)典理論認為，自然界中存在固有的耐藥菌和耐藥基因，它們通過(guò)質(zhì)粒傳遞或轉座子轉移等基因交流的方式，將耐藥基因傳遞給一些致病菌，從而產(chǎn)生了難以控制的超級耐藥致病菌如MRSA和VRE等［1］。對于耐藥菌而言，抗生素起到了一種篩選的作用：將藥物敏感性細菌殺死，為耐藥菌的生存排除了競爭的阻力，有利于耐藥菌群的生存和繁殖。
抗生素在臨床治療中的廣泛和長(cháng)期使用，不可避免地導致耐藥菌的出現，給抗菌治療帶來(lái)了許多困難。另外，抗生素作為促生長(cháng)劑被添加到動(dòng)物飼料中，也是耐藥菌出現的誘因之一。這些用于飼料的抗生素大多數可以人畜共用，長(cháng)期使用后篩選出的耐藥菌在人畜間傳遞很容易導致多種抗生素失效［1］�，F在的臨床研究發(fā)現，耐藥菌出現頻率越來(lái)越高，耐藥程度越來(lái)越嚴重，如果僅僅歸咎于抗生素篩選出的固有耐藥菌，恐怕難以圓滿(mǎn)的解答。
抗生素同紫外線(xiàn)、離子射線(xiàn)、重金屬和化學(xué)誘變劑一樣，是一種環(huán)境壓力，對細菌的生存造成一定程度的威脅，甚至通過(guò)對菌體的損傷導致其死亡［2］。而細菌無(wú)處不在，充分說(shuō)明了這一種群在各種惡劣環(huán)境中強大的生存能力和適應性。在遭受到環(huán)境壓力時(shí)，細菌會(huì )采取不同的應急策略來(lái)規避風(fēng)險、修復損傷，甚至改變自身的結構來(lái)適應各種環(huán)境的變化，如UV照射下大腸埃希菌的SOS反應，高溫環(huán)境下的熱休克反應和芽孢的形成等等，這些都是細菌針對某種特定壓力的響應。 有研究表明，當有抗生素作用時(shí)，細菌并不是平靜地面對死亡，它們中的一些亞群也會(huì )產(chǎn)生某些對于抗生素壓力的響應，如絲裂霉素C和喹喏酮在大腸埃希菌中誘發(fā)出的SOS反應。SOS反應是細胞的一種易錯修復機制，通過(guò)提高突變率降低菌體的死亡率［3，4］。但SOS反應并不是細菌中普遍存在的規律性反應，自然界仍存在許多非SOS型細菌，它們因為缺乏SOS反應體系，不能通過(guò)可誘導的修復來(lái)達到適應環(huán)境的目的，因此必須通過(guò)其它途徑加以補救。肺炎鏈球菌就是一種非SOS型細菌，在其菌體中沒(méi)有檢測到SOS反應相關(guān)的作用因子［5］。有實(shí)驗證明，肺炎鏈球菌中可誘導的感受態(tài)反應可作為一種SOS反應的替代，通過(guò)轉化作用最終產(chǎn)生更適宜生存的突變菌株［2］。
2 抗生素誘導的肺炎鏈球菌感受態(tài)
2.1 感受態(tài)和感受態(tài)調節系統
轉化，是一種基因交換的程序性機制，最早在肺炎鏈球菌中發(fā)現，現已證明存在于大多數細菌中。具有轉化能力的細菌在其生長(cháng)的某一階段能夠自然形成感受態(tài)，在此狀態(tài)下的細胞具有吸附、吸收外源裸露DNA片段的能力。能夠產(chǎn)生感受態(tài)的細菌中普遍存在著(zhù)一組受com調節子嚴密調控的感受態(tài)基因，在感受態(tài)刺激因子(competence stimulating peptide，CSP)的作用下開(kāi)啟基因的表達，用于完成吸收并重組外源DNA的生命活動(dòng)［6～8］。
由于肺炎鏈球菌對感受態(tài)刺激因子的作用反應迅速且高度同步，因此是研究感受態(tài)十分理想的模型［9，10］。肺炎鏈球菌中感受態(tài)基因的數量從最初發(fā)現的47個(gè)增加到124［9］或105［10］個(gè)(不同的文獻報道)，幾乎所有的基因都被組織在相鄰的基因簇中，被com調節子共同調控。它們按照功能和表達時(shí)間的先后，被劃分為早期感受態(tài)基因和晚期感受態(tài)基因。早期基因主要對感受態(tài)的形成起調節作用，并進(jìn)一步促使晚期感受態(tài)基因的表達；晚期感受態(tài)基因主要負責細胞對外源DNA的吸附、吸收和重組［7］。
在肺炎鏈球菌com調節子所調控的基因中，僅22個(gè)基因為轉化所必需，其中8個(gè)基因(comA/B，comC/D/E，comX1comX2和comW)是早期基因組中的成員，編碼的產(chǎn)物存在于感受態(tài)調控級聯(lián)反應中［11，12］。肺炎鏈球菌感受態(tài)刺激因子(CSP)為comC基因的表達產(chǎn)物，被ComAB蛋白成熟并轉運。comC編碼一個(gè)45個(gè)氨基酸殘基的感受態(tài)前導肽，ComAB蛋白從此前導肽的GlyGly結構后切割出成熟的17個(gè)氨基酸殘基的小肽即成熟的CSP［8，13］。
comD/E是一個(gè)二因素調節單位，受CSP的調控。comD的基因產(chǎn)物為CSP的受體，是一種跨膜蛋白，含有7個(gè)跨膜的α螺旋。ComD具有組氨酸激酶的活性，與相應的CSP結合后可磷酸化激活ComE蛋白。ComE蛋白為一轉錄因子，被激活后產(chǎn)生多重效應：一是與操縱子comC/D/E的啟動(dòng)子結合促進(jìn)這三個(gè)基因的表達，形成自身誘導的正反饋效應；二是可激活具有σ因子活性的ComX蛋白，而ComX同RNA聚合酶形成復合物，啟動(dòng)感受態(tài)晚期基因的表達。comW基因被認為是一種感受態(tài)所必需的依賴(lài)ComE的調節子，它通過(guò)阻止ClpP依賴(lài)的蛋白水解酶對ComX的水解作用來(lái)穩定ComX蛋白同RNA聚合酶的復合物，同時(shí)通過(guò)一些尚未明晰的機制來(lái)活化此復合物，使晚期基因的表達更加嚴密地被ComE傳導的信號所調控［14，15］(圖1)。
在com調節子控制的22個(gè)轉化必需基因中，剩余的14個(gè)基因屬于晚期基因，它們編碼的蛋白質(zhì)用于DNA的吸收(ccl，comEA/C，comFA/C，comGA/B/C/D/G)和處理單鏈DNA(coiA，dprA，recA和ssbB)［11］。至少有70個(gè)基因對轉化是非必需的，但由于感受態(tài)基因具有很多的重疊，因此它們不能被去除，并同時(shí)具備一些基因重疊后才有的功能［9］。這些“多余”的基因和功能說(shuō)明com調節子的作用不僅僅是誘導細胞形成感受態(tài)，還可能有著(zhù)其它的作用。有研究者認為“感受態(tài)”已經(jīng)不足以描述肺炎鏈球菌中comX所決定的生理狀態(tài)，因此開(kāi)始傾向于使用一個(gè)中性化而不帶任何功能的詞語(yǔ)“X態(tài)”(X state)來(lái)描述這一生理狀態(tài)［16］。
2.2 抗生素誘導的細菌感受態(tài)
對比絲裂霉素C在大腸埃希菌中誘發(fā)出SOS反應［17］，研究者在肺炎鏈球菌中進(jìn)行了相關(guān)試驗，使用了一個(gè)可轉錄的融合基因ssbB::luc，即一個(gè)Photinus 肺炎鏈球菌感受態(tài)調控系統pyralis內的可以編碼熒光素的報告基因luc和感受態(tài)晚期基因組中的ssbB的融合體［18］。ssbB基因是感受態(tài)晚期基因組中的一個(gè)代表，同時(shí)在SOS相關(guān)基因中也存在，它能夠編碼單鏈DNA結合蛋白SsbB，在基因重組中起到不可或缺的作用。加入一定濃度的絲裂霉素C后，觀(guān)察到融合基因表達水平上升，提示絲裂霉素C能夠誘導肺炎鏈球菌中重組相關(guān)基因ssbB的表達。對照實(shí)驗中采用一株com基因缺陷菌株，在加入絲裂霉素C后融合體不被表達［3］，這說(shuō)明絲裂霉素C誘導重組相關(guān)基因ssbB的表達，需要在細胞具有完整的com基因的前提下進(jìn)行，即細胞需要通過(guò)誘發(fā)感受態(tài)來(lái)開(kāi)啟同源重組的生理活動(dòng)。以上試驗證明某些抗生素如絲裂霉素C能夠誘導肺炎鏈球菌中com基因的表達，使正常細胞轉變?yōu)楦惺軕B(tài)細胞，促進(jìn)細胞內部的轉化作用。
除了絲裂霉素C，氟喹諾酮類(lèi)抗生素在肺炎鏈球菌中也能誘發(fā)感受態(tài)基因的表達［2，19］。絲裂霉素C通過(guò)阻礙復制叉的前進(jìn)而影響染色體的復制；喹諾酮類(lèi)抗生素(氟哌酸，左氧氟沙星和莫西沙星)的作用靶點(diǎn)是DNA解旋酶(拓撲異構酶II)，通過(guò)使拓撲異構酶與DNA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)阻止DNA的復制［19，20］。由此可見(jiàn)，這兩類(lèi)抗生素的作用機制都是阻礙細菌染色體的復制，當它們作為細菌生存環(huán)境中的壓力時(shí)可能傳遞著(zhù)相同的信號，即在肺炎鏈球菌中可以誘發(fā)出相同的響應——感受態(tài)。
在其它抗生素試驗中，對于肺炎鏈球菌感受態(tài)的誘發(fā)情況各不相同。作用靶點(diǎn)為核糖體的抗生素很多，如氨基糖苷類(lèi)抗生素、四環(huán)類(lèi)抗生素和大環(huán)內酯類(lèi)抗生素等，但由于核糖體內可作用的靶點(diǎn)較多，這些抗生素對感受態(tài)誘發(fā)的情況和機制更復雜。實(shí)驗表明氨基糖苷類(lèi)的卡那霉素和鏈霉素可以在肺炎鏈球菌中誘導出感受態(tài)，而大環(huán)內酯類(lèi)的紅霉素和四環(huán)素則無(wú)此作用［2，3］。并不是所有對DNA或RNA有損傷性的抗生素就一定能夠誘導出感受態(tài)，DNA促旋酶抑制劑新生霉素和RNA聚合酶抑制劑利福平就沒(méi)有這種誘導的作用。另外，糖肽類(lèi)抗生素中的萬(wàn)古霉素，β內酰胺類(lèi)抗生素和第三代的頭孢菌素頭孢噻肟同樣也不能誘導細胞轉變?yōu)楦惺軕B(tài)［3］。究竟具有哪些特征的抗生素能夠誘發(fā)細胞形成感受態(tài)，目前尚未有定論。
3 肺炎鏈球菌感受態(tài)與耐藥突變
在肺炎鏈球菌中多種抗生素能夠誘導細胞轉變?yōu)楦惺軕B(tài)，這種轉變?yōu)檫z傳轉化做好了生理上的準備。為了證明抗生素誘導的感受態(tài)細胞能夠有效率地進(jìn)行遺傳轉化，研究者設計了一個(gè)試驗：將攜帶鏈霉素耐受基因的DNA片段加入到肺炎鏈球菌培養物中，同時(shí)加入一定劑量(625ng/ml)的鏈霉素，并用無(wú)鏈霉素添加的培養物作為對照。鏈霉素必須適量，避免導致菌體大規模死亡。結果顯示，在鏈霉素處理過(guò)的培養物中出現了耐受，而對照實(shí)驗中則沒(méi)有出現耐受，因此可以確定鏈霉素誘發(fā)的感受態(tài)細胞能夠有效吸收外源DNA用于同源重組。如果再加入一定量的CSP(100ng/ml)并不會(huì )進(jìn)一步提高肺炎鏈球菌的轉化率，即抗生素能夠通過(guò)誘發(fā)感受態(tài)提高菌體的轉化效率，且這種誘發(fā)作用不依賴(lài)于CSP的含量［3］。同樣條件用絲裂霉素C或諾氟沙星替換鏈霉素重復此試驗，能夠觀(guān)察到同樣的現象。
當抗生素誘導細胞出現感受態(tài)后，細胞就能有效率地吸收合適的外源DNA片段，這為耐藥突變的出現提供了先決條件。但在肺炎鏈球菌群落中，如何有效率地獲取足夠并且合適的外源DNA用于遺傳轉化是研究人員關(guān)注的另一個(gè)問(wèn)題。
針對肺炎鏈球菌的研究表明，同一個(gè)群落里的細菌可以依照不同表型分為若干個(gè)亞群。就可否誘導出感受態(tài)而言，分為感受態(tài)型細胞和非感受態(tài)型細胞［21，22］，這些不同亞群的細胞在遺傳背景上存在著(zhù)某些差異�，F在有研究者認為，正是這些不同亞群的細胞，為遺傳轉化提供了豐富的基因資源。在抗生素的作用下，一個(gè)細菌亞群被誘發(fā)成為感受態(tài)細胞，而另一個(gè)細胞亞群則被藥物殺死，后者為前者提供了充足的基因資源［23］。
現已在多個(gè)肺炎鏈球菌感受態(tài)誘發(fā)模型中觀(guān)察到非感受態(tài)細胞亞群被溶解的現象，即異體胞溶(fratricide/sobrinicide)現象［21］。這些被溶解的細胞可能是一些因突變而喪失轉化能力的細胞，或是一些仍具有轉化能力但卻有著(zhù)不同表型的細胞。異體胞溶現象已被證實(shí)有一定生物學(xué)意義，是一種戰勝其它競爭者以取得生存優(yōu)勢的策略。異體胞溶是感受態(tài)亞群采取的一種侵略性反應，通過(guò)殺死其它亞群的細胞來(lái)獲取溶菌后的營(yíng)養物質(zhì)，如DNA和氨基酸［24］。同時(shí)，感受態(tài)細胞也會(huì )釋放毒力因子和過(guò)敏介質(zhì)來(lái)誘發(fā)感染，通過(guò)活化宿主體內的防御組織來(lái)穩定與宿主間的聯(lián)系，獲得暫時(shí)的生存優(yōu)勢。異體胞溶和遺傳轉化的協(xié)同作用可能暗示著(zhù)兩者的組合作用會(huì )給環(huán)境壓力下的細菌帶來(lái)更多的生存優(yōu)勢。
感受態(tài)相關(guān)基因的研究證實(shí)，四個(gè)晚期基因(cbpD，lytA，cibA和cibB)的產(chǎn)物與遺傳轉化作用無(wú)關(guān)，它們很可能在異體胞溶中起作用［22，24，25］。這些基因被CSP所誘導，分別編碼胞壁質(zhì)水解酶(一種主要的自溶物質(zhì))和一種二肽細菌素。胞溶過(guò)程涉及到第三種溶菌酶LytC的作用，這種物質(zhì)并不為CSP誘導的基因所編碼。同時(shí)，有兩種免疫因子被證明用來(lái)保護感受態(tài)細胞免受裂解［24］。同比枯草芽孢桿菌感受態(tài)的研究發(fā)現，枯草芽孢桿菌在誘發(fā)感受態(tài)的同時(shí)會(huì )啟動(dòng)細胞內生產(chǎn)表面活性劑的反應，這可能也是為了溶解其它細胞，釋放其中的DNA和氨基酸以備后續的遺傳轉化［26］。
4 總結和展望
當細菌面臨環(huán)境壓力時(shí)，會(huì )采取不同的方式來(lái)應對，即針對壓力的響應，如當用絲裂霉素C作用于大腸埃希菌時(shí)能夠誘發(fā)SOS反應。但并不是每一種細菌中都存在SOS反應，一些非SOS型細菌如肺炎鏈球菌在面臨生存壓力時(shí)必須采取其它的響應方式，以保證自身的生長(cháng)繁殖�，F有研究表明肺炎鏈球菌中感受態(tài)可作為SOS反應的替代�？股刈鳛橐环N環(huán)境壓力，可以在肺炎鏈球菌中誘發(fā)出感受態(tài)，為后續的遺傳轉化做好生理上的準備，并且也能通過(guò)誘發(fā)異體胞溶作用提供合適的外源DNA片段，為遺傳轉化做好物質(zhì)上的準備。
感受態(tài)在整體上是被嚴密控制的，通過(guò)在一些最有代表性的物種內研究感受態(tài)的調節機制，可以了解這一過(guò)程是如何同細胞的整體調節網(wǎng)絡(luò )聯(lián)系起來(lái)的。盡管對菌體誘發(fā)感受態(tài)的機制了解得尚不夠確切，但是這里所有的數據都能夠說(shuō)明誘發(fā)感受態(tài)的一個(gè)主要目的是通過(guò)轉化來(lái)實(shí)現整體的遺傳多樣化。感受態(tài)的誘導對于一些像肺炎鏈球菌這樣的非SOS型菌種來(lái)說(shuō)是十分重要的，因為這可能是這些菌株實(shí)現遺傳多樣化的唯一途徑。
然而感受態(tài)的研究過(guò)程中還存在著(zhù)許多未能解釋清楚的問(wèn)題，如感受態(tài)相關(guān)基因中看似“多余”的基因在壓力響應的過(guò)程中起到了怎樣的作用？是否能夠誘導感受態(tài)的菌種，都同時(shí)存在異體胞溶用來(lái)獲取同源DNA？抗生素誘導感受態(tài)的現象在細菌中是否普遍存在……，相信這些問(wèn)題將會(huì )在今后的研究中逐一得到解決。
目前的研究結論告訴我們：抗生素作為環(huán)境中的壓力，能夠誘發(fā)細胞轉變?yōu)楦惺軕B(tài)。這也許能夠從理論上解釋一些抗生素濫用后耐藥菌頻出的原因。不合理地使用抗生素可能誘導細胞高頻率出現感受態(tài)，提高轉化后突變出現的頻率，通過(guò)抗生素的篩選作用，耐藥菌很快占據絕對的生存優(yōu)勢，危害人體健康。這也警示我們必須合理使用抗生素，否則若干年后面對猖狂的耐藥菌，人類(lèi)將陷入無(wú)藥可用的境地。
作者：齊曉丹 陳代杰《中國抗生素雜志》
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