注射用法羅培南鈉對金葡菌的體內外抗菌活性研究

【摘要】  目的 研究注射用法羅培南鈉對臨床分離的金葡菌的體內外抗菌活性。方法 用頭孢西丁紙片法在近年來(lái)本室保存的臨床分離金葡菌中篩選耐甲氧西林的金葡菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)，用瓊脂平板稀釋法測定法羅培南和萬(wàn)古霉素對甲氧西林敏感的金葡菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus，MSSA)和MRSA菌株的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。根據MIC選擇對法羅培南敏感、中度和高度耐藥的MRSA菌株及1株MSSA建立小鼠腹膜炎模型，用注射用法羅培南鈉及萬(wàn)古霉素通過(guò)靜脈注射進(jìn)行感染動(dòng)物的治療，評價(jià)對感染小鼠的保護作用。結果 151株金葡菌中共分離出65株MRSA，陽(yáng)性率為43%；體外試驗法羅培南和萬(wàn)古霉素對86株MSSA均敏感。65株MRSA對法羅培南敏感者10株，其余均耐藥；對萬(wàn)古霉素均敏感。注射用法羅培南鈉對4株菌的ED50分別為38.3、38.6、71.9和7.07mg/kg；萬(wàn)古霉素則為2.25、10.18、20.85和1.77mg/kg。結論 注射用法羅培南鈉對MSSA有良好的體內和體外抗菌活性；注射用法羅培南鈉對MRSA無(wú)效，即使體外敏感。

【關(guān)鍵詞】  羅培南鈉； 金葡菌； 體外抗菌活性； 體內抗菌活性

    ABSTRACT  Objective  To evaluate the antibacterial activities of faropenem sodium for injection against S.aureus in vivo and in vitro.  Methods  Methicillin resistant S.aureus (MRSA) was screened from clinical isolated S.aureus by cefoxitin disc diffusion method. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of faropenem and vancomycin against methicillin sensitive S.aureus (MSSA) and MRSA were determined by agar dilution method. Mice peritonitis models were established by 3 MRSA (sensitive, moderate and severe resistant to faropenem respectively) and MSSA strains and mice were treated introvenously with faropenem sodium and vancomycin for injection.  Results  Sixty�瞗ive MRSA strains were screened from 151 clinical isolated S.aureus and the positive rate of MRSA was 43%. All MSSA were sensitive to faropenem and vancomycin in vitro. All MRSA were sensitive to vancomycin, but only 10 of them were sensitive to faropenem. In four groups, the median effective dose (ED50) of faropenem were 38.3, 38.6, 71.9 and 7.07 mg/kg respectively; vancomycin were 2.25, 10.18, 20.85 and 1.77 mg/kg respectively.  Conclusion  The antibacterial activities of faropenem sodium for injection against MSSA in vivo and in vitro are strong. Faropenem is ineffective in vivo to MRSA, even when it was sensitive in vitro.

    KEY WORDS  Faropenem sodium;  Staphylococcus aureus;  In vivo activity;  In vitro activity

   法羅培南(faropenem，FAPM)是日本Suntory公司開(kāi)發(fā)的世界上第一個(gè)具有青霉烯基本母核的口服抗生素，于1997年首先獲準在日本上市，商品名為Farom。國外文獻報道，法羅培南抗菌譜廣，對需氧和厭氧革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌均有很強的抗菌活性，且對細菌產(chǎn)生的β��內酰胺酶高度穩定［1～4］。江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司研制的口服法羅培南已經(jīng)在國內上市，在此基礎上，該公司又研制了注射用法羅培南鈉。本研究測定注射用法羅培南鈉對臨床分離的金葡菌(包括MSSA和MRSA)的體內和體外抗菌活性，并與注射用鹽酸萬(wàn)古霉素比較，為進(jìn)一步研究提供試驗資料。

    1  材料與方法

    1.1  試驗藥品

    注射用法羅培南鈉的規格為每瓶1g，批號20050713，江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司研制。注射用鹽酸萬(wàn)古霉素的規格為每瓶500mg，批號WM16142，Eli Lilly公司產(chǎn)品。

    1.2  試驗菌株

    金葡菌菌株來(lái)自本室保存菌株，為近三年來(lái)重慶醫科大學(xué)附屬第一醫院自臨床患者的痰、血、分泌物等標本中分離，并經(jīng)本院鑒定。金葡菌ATCC29213(甲氧西林敏感，MSSA)由汕頭大學(xué)醫學(xué)院錢(qián)元恕教授饋贈。實(shí)驗質(zhì)控菌株為金葡菌ATCC25923。

    1.3  主要試劑

    (1)腹膜炎模型添加劑  高活性干酵母(北方同正)，配成5%(W/V)濃度后高壓滅菌。20%無(wú)菌鼠糞提取物(sterile rat feces extracts，SRFE)制備方法見(jiàn)參考文獻［5］。將SRFE和高活性干酵母液配成3∶1的液體用于稀釋菌液。

    (2)培養基  Mueller�睭inton瓊脂固體及液體培養基，杭州天和微生物制品廠(chǎng)出品。BHI(brain and heart infusion)液體培養基，Difco公司產(chǎn)品。

    (3)頭孢西丁紙片(紙片含藥量30μg頭孢西丁)，Oxoid公司產(chǎn)品。

    1.4  試驗動(dòng)物

    清潔級近交系BABL/c小鼠，體重18～22g，雌、雄各半，購自本校實(shí)驗動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號SCXK(渝20020001)。

    1.5  方法

    (1)MRSA的篩選  根據臨床實(shí)驗室標準化研究所(CLSI)2007年抗微生物藥物敏感試驗標準，應用紙片擴散法試驗條件，孵育24h；如耐藥則在孵育18h后可報告結果。使用反射光閱讀頭孢西丁紙片試驗。頭孢西丁對金葡菌紙片擴散法抑菌環(huán)直徑≤19mm應報告對苯唑西林耐藥，≥20mm應報告對苯唑西林敏感。推薦的質(zhì)控菌株(質(zhì)控允許范圍：30μg頭孢西丁，紙片抑菌環(huán)直徑23～29mm)金葡菌ATCC25923。

    (2)細菌體外藥敏實(shí)驗  按照CLSI推薦的瓊脂平皿稀釋法測定所有金葡菌菌株對法羅培南鈉和萬(wàn)古霉素的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。33～35℃孵育16～18h；測萬(wàn)古霉素需24h。菌落生長(cháng)被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對檢測菌的MIC。推薦的質(zhì)控菌株金葡菌ATCC25923。法羅培南參照美羅培南的標準即為4μg/ml(北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司試驗結果)，萬(wàn)古霉素的判斷標準為2μg/ml［5］。凡是小于或等于兩種藥物的臨界濃度為敏感，大于為耐藥，并以此統計敏感率。

    (3)感染保護試驗

    ①菌液稀釋  將試驗用菌于試驗前1d接種于2ml MH肉湯中(MRSA菌株使用BHI肉湯)，37℃培養6h，取菌液0.1ml轉種于10ml營(yíng)養肉湯內，37℃培養18h，即為試驗用菌原液。將菌原液適當稀釋?zhuān)�用添加劑稀釋至感染�?dòng)物所需終濃度。

    ②藥液稀釋  采用低比值系列稀釋法，兩個(gè)相臨劑量組劑量差對數值i為0.3010。

    ③最低致死劑量(minimal lethal dose，MLD)測定  實(shí)驗小鼠按空腹體重和性別隨機分為幾組，每組6只。將菌原液適當稀釋?zhuān)��?SPAN lang=EN-US>5%高活性干酵母液和無(wú)菌鼠糞提取物稀釋為不同濃度，一組為一個(gè)濃度，每只小鼠腹腔注射0.5ml菌液，記錄感染后一周各組死亡數或存活數，6只小鼠全部死亡組的最低濃度為MLD。

    ④動(dòng)物保護試驗  半數有效量(median effective dose，ED50)測定  禁食后體重18～22g BABL/c小鼠隨機分組，每組10只，雌、雄各半。用0.5ml的最低致死劑量感染小鼠，1h后給予不同濃度的藥物(6～7個(gè)濃度組)，每只0.2ml，靜脈注射�？瞻讓φ战M注射0.2ml生理鹽水。記錄感染后24、48、72h直至1周內各給藥組及對照組小鼠的死亡數或存活數，用BLISS法進(jìn)行ED50及ED50的95%可信限計算。

    2  結果與分析

    2.1  MRSA的篩選結果

    151株金葡菌中共分離出65株MRSA，陽(yáng)性率為43%。

    2.2  體外抗菌試驗

    86株MSSA對法羅培南和萬(wàn)古霉素均敏感。65株MRSA中，10株對法羅培南敏感，敏感率為15.38%；所有MRSA菌株均對萬(wàn)古霉素敏感，敏感率100%(表1)。

2.3  體內抗菌試驗

    根據MIC結果選擇4株菌株建立小鼠腹膜炎模型。對法羅培南敏感、低度和高度耐藥的MRSA菌株各1株，自編號分別為113，77和39；以對法羅培南敏感的金葡菌ATCC29213(MSSA標準株)。小鼠腹腔注射細菌后出現畏寒、寒戰，活動(dòng)力和食欲下降。死亡小鼠尸檢肉眼觀(guān)察，各給藥組和對照組小鼠肝臟、腎臟可見(jiàn)大小不等的膿點(diǎn)，少數可見(jiàn)心外膜的膿點(diǎn)，其它臟器未見(jiàn)異常。實(shí)驗組與對照組比較無(wú)明顯差異。

    法羅培南和萬(wàn)古霉素對MSSA菌株都顯示了很強的體內抗菌活性。對于MRSA，法羅培南的體內抗菌活性低于萬(wàn)古霉素，ED50值為萬(wàn)古霉素的3.45～17倍。即便體外顯示敏感，ED50值仍較高(38.30mg/kg)，體內、外抗菌活性不一致。隨著(zhù)細菌對法羅培南耐藥性的增強，法羅培南和萬(wàn)古霉素的ED50也隨之增大(表2)。

    3  討論

    法羅培南是一種新型青霉烯類(lèi)抗生素，臨床研究顯示其療效好，安全性高，不良反應少。法羅培南對需氧及厭氧革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌均顯示出廣譜的抗菌活性，尤其對葡萄球菌、腸球菌的需氧革蘭陽(yáng)性菌及擬桿菌等厭氧菌的抗菌活性明顯優(yōu)于其它β��內酰胺類(lèi)［6］。與其它青霉烯類(lèi)一樣，法羅培南通過(guò)和PBP結合抑制細菌細胞壁的合成達到殺菌作用。當金葡菌置于法羅培南的MIC的1/8或1/4溶液時(shí)形成不規則隔膜。在1倍的MIC或更高時(shí)，大量的金葡菌溶解。這種由法羅培南所觸發(fā)的細菌形態(tài)變化與所報道的與PBP的親和力是一致的。這樣對革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌，法羅培南對PBP高親和性通過(guò)明顯的濃度依賴(lài)的殺菌作用反映出來(lái)［7］。

    注射用法羅培南鈉在國外尚未上市。江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司在口服法羅培南基礎上研制的注射用法羅培南鈉為國內首創(chuàng )，為臨床用藥提供了更多選擇。注射用法羅培南鈉對金葡菌的體外和體內抗菌活性目前國內和國外均無(wú)報道。本研究中，注射用法羅培南鈉對臨床分離的MSSA菌株顯示了良好的體外和體內抗菌活性，抗菌效果與萬(wàn)古霉素相似。

    Christof等［8］測定法羅培南對31株臨床分離的MRSA的體外抗菌活性，其中18株的MIC≤2mg/L，敏感率為58.06%；有9株的MIC>128mg/L，且MIC90>128mg/L。Christof等研究顯示口服法羅培南對MRSA有較好的體外抗菌活性，但在我們的實(shí)驗中，注射用法羅培南鈉對MRSA的體外敏感率僅為15.38%，且在體外敏感的菌株在體內試驗中ED50值較高，提示注射用法羅培南鈉對MRSA無(wú)效，即使體外敏感。法羅培南鈉對MRSA的體外和體內抗菌活性是不一致的。

    表1        法羅培南和萬(wàn)古霉素對金葡菌的體外抗菌活性（略）   

    表2        法羅培南和萬(wàn)古霉素對金葡菌的體內抗菌活性（略）

 萬(wàn)古霉素是控制MRSA等重癥感染的特效藥，目前尚未分離到耐萬(wàn)古霉素的MRSA。本次試驗篩選出的MRSA菌株在體外均對萬(wàn)古霉素敏感，體內實(shí)驗也證實(shí)了萬(wàn)古霉素對小鼠的保護作用。萬(wàn)古霉素確實(shí)是治療MRSA等重癥感染的有效藥物。

作者：羅濤 黃文祥 吳利  

作者單位：重慶醫科大學(xué)附屬第一醫院 重慶市傳染病寄生蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗室， 重慶400016

【參考文獻】

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［3］ Dalhoff A, Nasu T, Okamoto K. Beta�瞝actamase stability of faropenem ［J］. Chemotherapy,2003,49(5):229～236.

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［5］ 臨床實(shí)驗室標準化協(xié)會(huì ). 抗微生物藥物敏感試驗的執行標準第十七版［M］. 臨床實(shí)驗室標準化協(xié)會(huì )，2007：38～45.

［6］ 孫小平，黃文祥. 青霉烯及其代表藥物法羅培南的研究進(jìn)展［J］. 國外醫藥抗生素分冊，2005，26(3)：111～115.

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