紫外誘變復合重金屬離子抗性突變選育霉酚酸高產(chǎn)菌株

【摘要】  以霉酚酸產(chǎn)生菌1321#為出發(fā)菌株，采用紫外線(xiàn)誘變并復合重金屬Cr6+、Cu2+抗性株篩選，獲得一株遺傳性狀穩定且搖瓶發(fā)酵水平提高86.6%的164#高產(chǎn)菌株。經(jīng)發(fā)酵配方優(yōu)化，該菌株的搖瓶單位再度提升了5.5%，顯示出了高產(chǎn)潛力。

【關(guān)鍵詞】  霉酚酸； 誘變； 重金屬離子； 抗性篩選

    ABSTRACT  A mycophenoilc acid (MPA) producing strain Penicillium brevicompactum #1321 was treated by UV, followed by resistance selection with heavy metal Cr6+ and Cu2+. A stable strain #164 was obtained with the potency of MPA higher by 86.6% than starting strain in shaking culture. The potency was further improved by 5.5% in the optimized fermentation medium.

    KEY WORDS  Mycophenoilc acid;  Mutagenesis;  Heavy metal ion;  Resistant screening

     霉酚酸(mycophenoilc acid，MPA)為短密青霉(Penicillium brevicompactum)產(chǎn)生的抗真菌、抗腫瘤并具免疫抑制作用的抗生素［1］。MPA是次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶的可逆性抑制劑，能選擇性地抑制淋巴細胞活性，它的2-乙基酯類(lèi)衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代免疫抑制劑，在臨床器官移植和自身免疫性疾病的治療方面展示了良好的應用前景。做為合成MMF的前體化合物，提高M(jìn)PA的工業(yè)化水平對于生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)十分重要。

    MPA產(chǎn)生菌原始菌株的產(chǎn)量有限，其高產(chǎn)菌株的選育研究近年來(lái)漸成熱點(diǎn)。張琴等［2］報道采用紫外線(xiàn)及亞硝基胍誘變產(chǎn)生菌，以MPA和三氟乙酸為抗性篩選標記，篩選到了高產(chǎn)突變株；楊亞勇等［3］報道紫外線(xiàn)和亞硝酸復合誘變MPA產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體，經(jīng)原生質(zhì)體再生獲得了高產(chǎn)菌株。本文報道了應用紫外誘變與定向篩選重金屬離子抗性株相結合的方式，進(jìn)行MPA育種研究，并獲得了高產(chǎn)穩定的突變株。

    1.1  出發(fā)菌種

    短密青霉(Penicillium brevicompactum)1321#。

    1.2  培養基及培養條件

    (1)分離及斜面培養  馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，26℃培養5d～7d。

    (2)種子培養  淀粉10g，葡萄糖5g，酵母粉3g，氯化鈉1g，硫酸鎂0.5g，碳酸鈣1g，自來(lái)水1000ml，自然pH。26℃，220r/min搖床，培養2d。

    (3)發(fā)酵培養  淀粉12g，蔗糖50g，玉米漿50g，魚(yú)粉蛋白胨2g，酵母粉13g，硫酸銨4g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈣2g，碳酸鈣0.5g，自來(lái)水1000ml，自然pH。26℃，220r/min搖床，培養7d。

    1.3  菌種誘變與篩選

    (1)紫外照射單因子處理  由出發(fā)菌株的成熟斜面制得單孢子懸液置平皿中，紫外燈(30W，波長(cháng)254nm， 距離40cm)照射4～5min， 孢子液適當稀釋后涂布于PDA平板培養基上。培養5d后挑取單菌落進(jìn)行搖瓶篩選。

    (2)紫外照射復合Cr6+、Cu2+平板抗性處理  制備含有0.6%、0.7%和0.8%鉻酸鈉以及0.02%、0.05%和0.1%硫酸銅的PDA平板，將UV處理過(guò)的孢子液適當稀釋并涂布于含Cr6+、Cu2+平板培養基上，培養5d～7d后挑選孢子豐富、菌落直徑相對較大的抗性菌落進(jìn)行搖瓶篩選。

    1.4  發(fā)酵液?jiǎn)挝粰z測

    樣品處理  定量吸取發(fā)酵液，加入1.5倍的無(wú)水乙醇，充分振蕩1h，3000r/min離心10min。取上清液由HPLC測效價(jià)。

    HPLC測定  色譜柱Agilent Extend-C18(4.6mm×250mm)；流動(dòng)相為甲醇∶0.1%醋酸(70∶30)；檢測波長(cháng)250nm；柱溫40℃。

    MPA對照品為Sigma公司產(chǎn)品。

    2.1  菌種誘變系譜

    2.2  搖瓶篩選結果

    出發(fā)菌株1321#經(jīng)過(guò)UV誘變處理結合Cr6+、Cu2+抗性株篩選，最終獲得164#高產(chǎn)突變株，其搖瓶產(chǎn)量比1321#提高了86.6%(表1)。

    由表1可見(jiàn)，UV+Na2CrO4復合處理篩選到的942#菌株的產(chǎn)量提高幅度最大，隨后進(jìn)行的UV+CuSO4復合處理得到的164#菌株其發(fā)酵單位進(jìn)一步提升。

    2.3  高產(chǎn)突變株的菌落形態(tài)變化

    164#高產(chǎn)突變株的菌落形態(tài)與原始菌株1321#相比有了較大變化。1321#為圓形扁平狀菌落，而164#的菌落中央凸起，呈對稱(chēng)性放射褶皺狀。且有直徑變小、孢子量減少的趨勢。表1    三種誘變篩選方式獲得正變株(系譜菌株)的相對搖瓶產(chǎn)量以出發(fā)菌株CK1321#搖瓶產(chǎn)量為100%計。2.4  高產(chǎn)菌株遺傳穩定性考察

    164#菌株經(jīng)連續四次斜面傳代后與F1代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵單位的比較，其子代效價(jià)與F1代基本持平。證明該菌株的遺傳穩定性良好。

    2.5  發(fā)酵配方優(yōu)化

    以164#做為試驗菌株，對發(fā)酵培養基中的淀粉、蔗糖、酵母粉、魚(yú)粉蛋白胨、玉米漿進(jìn)行U15(155)均勻設計試驗。經(jīng)驗證，配方優(yōu)化后164#菌株的搖瓶單位提高了5.5%。

    我公司的MPA產(chǎn)生菌系從土壤中分離得到的野生菌株，經(jīng)過(guò)前期的誘變育種工作，本試驗出發(fā)菌株1321#的發(fā)酵能力已達到產(chǎn)業(yè)化水平。為進(jìn)一步增強產(chǎn)品的市場(chǎng)競爭力，我們面臨的任務(wù)是選用快速有效的育種手段，短期內將菌種的單位產(chǎn)量大幅提高，以滿(mǎn)足生產(chǎn)的需求。

    在菌種選育過(guò)程中，誘變和篩選方法的選擇是十分重要的。Cu2+、Cr6+等重金屬離子對微生物有一定毒性［4］，當培養基中的重金屬離子達到一定濃度時(shí)大多數產(chǎn)生菌的生長(cháng)被抑制，只有對該金屬離子具有抗性的菌株才能生長(cháng)�？剐缘臋C制可能是由于菌體分泌大量產(chǎn)物或其中間體和有毒的金屬離子結合，形成無(wú)毒或低毒的復合物以解除對菌體自身的抑制作用［5］，并使之失去終產(chǎn)物的反饋控制。這樣就可以從金屬離子抗性突變株中篩選到能大量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株。

    我們對1321#菌株采用了包括UV誘變以及UV復合Cr6+、Cu2+抗性篩選的方法，多輪選育后獲得164#高產(chǎn)突變株,再經(jīng)發(fā)酵配方優(yōu)化，其搖瓶產(chǎn)量比出發(fā)菌株累計提高92.1%，為生產(chǎn)成本的降低奠定了良好的基礎。

 

 作者：婁忻 賈嘯靜 劉勝利 張華《中國抗生素雜志》

  ［1］ 李曉虹，龔炳永，朱寶泉. 微生物來(lái)源的免疫抑制劑研究現狀［J］. 國外醫藥抗生素分冊，2000，21(6)：271～277.

［2］ 張琴，胡海峰，朱寶泉. 麥考酚酸高產(chǎn)菌株的選育［J］. 中國醫藥工業(yè)雜志，2006，37(7)：452～453.

［3］ 楊亞勇，李長(cháng)洪，孟文偉. 麥考酚酸產(chǎn)生菌原生質(zhì)體誘變育種的研究［J］. 中國抗生素雜志，2006，31(10)：587～590.

［4］ 章名春. 工業(yè)微生物誘變育種［M］. 北京：科學(xué)出版社，1984：206.

［5］ 胡立勇，宋有禮，童村. 桿菌肽產(chǎn)生菌的推理選育［J］. 中國抗生素雜志，1988，13(6)：391～396.