青霉素高產(chǎn)菌株的理性篩選

【摘要】  以青霉素生產(chǎn)菌種87117#為出發(fā)菌種，采用紫外線(xiàn)誘變復合前體動(dòng)態(tài)后處理的方法，結合限氧條件下的搖瓶篩選，從177支前體抗性株中篩出XY-137#高產(chǎn)突變株。該菌株搖瓶效價(jià)平均提高了8.8%,且遺傳特性穩定，單位菌絲產(chǎn)物合成能力強。XY-137#菌株在百?lài)嵐拗薪?jīng)過(guò)近百批的生產(chǎn)驗證，其放罐效價(jià)、發(fā)酵指數、罐批產(chǎn)量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。

【關(guān)鍵詞】  紫外誘變； 動(dòng)態(tài)后處理； 理性篩選； 青霉素高產(chǎn)菌株

    ABSTRACT  Using Penicillium chrysogenum #87117 as starting strain, a penicillin high yield strain #XY-137 was obtained by UV irradiation combined with precursor-resistant strain in shake flask selection method under limited oxygen. Penicillin potency of strain #XY-137 was increased by 8.8% cultured in shaking flasks. Average productivity of about 100 batches fermentation level was increased by 2.69%～5.66% than that of strain #87117 in 100-ton fermentor.

    KEY WORDS  UV mutagenesis;  Dynamic post-treatment;  Rational screening;  Penicillin high-producing strain

    由于青霉素原料的后加工與半合成領(lǐng)域愈來(lái)愈廣泛，世界青霉素市場(chǎng)競爭十分激烈。生產(chǎn)廠(chǎng)家唯有不斷地提高生產(chǎn)水平，降低生產(chǎn)成本以增強企業(yè)的競爭力，而優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌種的選育和應用是其中的基礎和關(guān)鍵。

    隨著(zhù)青霉素菌種生產(chǎn)能力的提高，傳統育種方法的局限性越來(lái)越明顯。理性化篩選是應用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的原理，根據已知或可能的目的產(chǎn)物生物合成途徑的調控機制和產(chǎn)物的分子結構，設計篩選方法，定向選出有效的性狀突變株。我們依據理性育種的理念，參照現有生產(chǎn)條件設立基本篩選模型，采用紫外輻射震動(dòng)工業(yè)生產(chǎn)菌種穩定的遺傳結構，再輔以限氧條件下耐前體突變株的篩選，達到選育高產(chǎn)菌株的目的。

    1  材料與方法

    1.1  出發(fā)菌種

    青霉素生產(chǎn)菌種Penicillium chrysogenum 87117#。1.2  培養基

    (1)分離及斜面培養基  蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl、CaSO4、微量元素、瓊脂。

    (2)種子培養基  以蔗糖、玉米漿為碳、氮源。

    (3)發(fā)酵培養基  以乳糖、玉米漿為主要碳、氮源，加無(wú)機鹽類(lèi)組成。

    1.3  菌種誘變與篩選

    (1)紫外誘變  將出發(fā)菌株的單孢子懸液置紫外燈下40cm處照射90s。

    (2)前體動(dòng)態(tài)后處理  定量吸取經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射后的孢子液，分別加入含有不同劑量的前體(苯乙酸胺)的種子培養基試管中，使每支試管的前體終濃度在0～4.8%之間。將上述試管置25℃恒溫振蕩培養18h左右，然后稀釋分離在固體培養基平板上。

    (3)前體抗性菌落檢出  平板置25℃恒溫培養8d。從耐受不同濃度前體處理后長(cháng)出的抗性菌落中挑選孢子相對豐富、組織比較致密的菌落進(jìn)行斜面傳代培養，以備搖瓶篩選。

    (4)搖瓶定向篩選低氧耗、低菌絲量的高產(chǎn)菌株  將搖瓶機轉速由通常的220r/min降至160r/min，在低通氣條件下進(jìn)行搖瓶篩選。后續的高產(chǎn)株特性考察和工藝優(yōu)化均在此條件下進(jìn)行。

    搖瓶篩選考察指標為發(fā)酵效價(jià)和菌絲生長(cháng)量(packed mycelial volume,pmv)。

    1.4  樣品檢測

    發(fā)酵液倒入刻度離心管中，3000r/min離心10min。取上清液，用美國OI公司Flow SolutionⅣ化學(xué)自動(dòng)分析儀檢測其中的青霉素效價(jià)(u/ml)。沉淀部分所占體積與發(fā)酵液體積的比值即為pmv(%)。

    2  結果

    2.1  XY-137#高產(chǎn)突變株的選育

    出發(fā)菌株87117#先經(jīng)過(guò)兩次自然選育，然后采用紫外線(xiàn)復合前體動(dòng)態(tài)后處理，挑取177支抗性株，在限氧條件下進(jìn)行搖瓶篩選。于3.84%前體耐受濃度下獲得XY-137#高產(chǎn)突變株，以87117#為對照，其5d和7d搖瓶相對效價(jià)分別為107.4%和110.3%，搖瓶效價(jià)平均提高了8.8%。

2.2  XY-137#菌株特性考察

    (1)菌種純度  XY-137#菌株自然分離后正常型菌落達96.3%，符合上生產(chǎn)罐的要求。

    (2)斜面周期  XY-137#與出發(fā)菌株相比其斜面外觀(guān)有所改變，孢子長(cháng)勢較弱，顏色明顯變淺。若仍按原周期培養斜面，則種子瓶的培養時(shí)間需延長(cháng)4～6h。經(jīng)過(guò)試驗比較，將斜面培養周期推后1d，種子瓶生長(cháng)正常，且搖瓶前期發(fā)酵效價(jià)略有提高。

    (3)單位菌絲產(chǎn)物合成能力  由圖1可知，與出發(fā)菌種相比XY-137#菌株的搖瓶效價(jià)有顯著(zhù)提高，而菌絲量較低，說(shuō)明XY-137#菌株單位菌絲產(chǎn)量明顯優(yōu)于87117#對照菌種。

    1：87117#相對效價(jià)；  2：XY-137#相對效價(jià)；

    3：87117#菌絲生長(cháng)量；  4：XY-137#菌絲生長(cháng)量

    圖1    XY-137#與87117#菌種搖瓶相對效價(jià)和菌絲量比較    (4)穩定性試驗  XY-137#菌株經(jīng)斜面傳代后進(jìn)行搖瓶考察，F1～F4代相對效價(jià)依次為100%、98.9%、101.1%和99.7%，證明其穩定性良好。

    2.3  XY-137#菌株搖瓶工藝優(yōu)化

    (1)培養基改良  進(jìn)行了多輪均勻設計試驗。種子瓶經(jīng)回歸分析得到的最優(yōu)配方中，減少了質(zhì)量不易控制的玉米漿加量，增加適量的無(wú)機氮源，碳源比例也稍做了增加，優(yōu)化后種子瓶的菌濃明顯增大，發(fā)酵效價(jià)提高了7.5%。

    發(fā)酵培養基則基于大罐的用料和配比，嘗試添加適量固形有機氮源來(lái)穩定搖瓶效價(jià)。經(jīng)搖瓶發(fā)酵試驗，在多種有機氮源中最終選擇加入少量的麩質(zhì)粉，搖瓶效價(jià)提高了6%左右。

    (2)增加前體補入量  考慮到XY-137#系耐前體突變株，故欲增加前體補入量，以滿(mǎn)足高產(chǎn)菌株的需要。結果顯示將前體濃度調高3%，補入體積不變，XY-137#菌株搖瓶效價(jià)提高了9.4%(表1)。表1    前體增量試驗結果

    2.4  XY-137#菌株生產(chǎn)試驗

    XY-137#菌株在100m3罐中考察其生產(chǎn)能力及對原材料和工藝條件的適應性。經(jīng)統計，該菌株放罐95批，在發(fā)酵周期短4h、主要原材料消耗沒(méi)有增加的情況下，XY-137#菌株的放罐效價(jià)、發(fā)酵指數、罐批產(chǎn)量比同期87117#菌株分別提高了3.83%、5.66%和2.69%。

    上罐試驗同時(shí)還證實(shí)XY-137#菌株不僅具備高產(chǎn)能力，而且發(fā)酵液粘度比87117#有所降低，可以減少動(dòng)力消耗。

    3  討論

    對于青霉素這樣產(chǎn)量已達較高水平的老品種，其產(chǎn)生菌久經(jīng)人工選育，不論在遺傳背景或生理特性方面都發(fā)生了復雜的變化。因此在做進(jìn)一步誘變育種時(shí)，不但要考慮誘變劑的選擇，更重要的是對篩選方法作合理的設計，使變異株產(chǎn)量的提高和主要性狀的改變能明顯地表達出來(lái)。有報道根據青霉素的生物合成途徑在固體培養基上加入纈氨酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙酸等底物進(jìn)行抗性篩選［1，2］；或采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，使兩株營(yíng)養缺陷型菌株融合，篩選融合子［3］均取得了一定的效果。

    前體對青霉素產(chǎn)生菌有毒性，能抑制其孢子發(fā)芽和菌絲的分支［4］。篩選以前體為標記的耐前體高產(chǎn)突變株，不僅可以解除毒性，而且使前體直接摻入抗生素的生物合成而提高產(chǎn)量［5］。由于動(dòng)態(tài)后處理有富集正變株的作用［6］，故可以增加高產(chǎn)株的篩出幾率。

    確定篩選條件決定著(zhù)菌種選育的方向。特別是生產(chǎn)菌種，定向篩選的目標皆應來(lái)自大生產(chǎn)的需要。在發(fā)酵工業(yè)中，降低氧耗、降低動(dòng)力消耗對生產(chǎn)成本的降低有著(zhù)重要意義。本試驗在低通氣條件下篩選菌絲量較少的高產(chǎn)菌株，使選育到的菌株更具實(shí)際應用價(jià)值。

生產(chǎn)實(shí)踐證明，XY-137#高產(chǎn)菌株特性達到理性篩選設計要求。

作者：婁忻 張莉 劉靚 張玉蓮 陳麗華 劉靜 賀建功《中國抗生素雜志》

【參考文獻】

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［6］ 胡立勇，宋有禮，童村. 桿菌肽產(chǎn)生菌的推理選育［J］. 中國抗生素雜志，1988，13(6)：395

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