黃連等6種中草藥對都柏林念珠菌抗菌活性的比較研究

【摘要】  　　目的比較黃連、知母、七葉一枝花、黃芩、大黃、五倍子對都柏林念珠菌的體外抗菌活性。方法采用出芽實(shí)驗法、肉湯微量稀釋法和傳統的瓊脂擴散法。結果都柏林念珠菌對黃連、知母、七葉一枝花、黃芩敏感，抑菌圈直徑在23~28 mm之間，MIC分別是：0.06~0.125，0.06~0.125，0.125~0.25，0.25~0.5 g/ml。黃連、知母、黃芩、大黃抑制出芽效果更好。結論黃連、知母、黃芩對都柏林念珠菌具有較好的抑菌效果，且抑制都柏林念珠菌出芽效果也較好。

【關(guān)鍵詞】  中草藥 都柏林念珠菌 抗菌活性 出芽實(shí)驗法

　　Abstract：ObjectiveTo compare six Chinese herbal medicine' antimicrobial activity on Candida dubliniensis. MethodsThe methods of agar plate diffusions ,tube continuous dilution and germinative test were adopted.ResultsCoptis chinensis Franch，Anemarrhena asphodeloidses Bunge，Paris poludhulla Smith,Scutellaraia baicalensis Georgi  had good antimicrobial activity on Candida dubliniensis, the diameter of bacteriostatic circle was between 23 and 28 millimetreand the MIC was 0.06~0.125，0.06~0.125，0.125~0.25，0.25~0.5 g/ml.Coptis chinensis Franch，Anemarrhena asphodeloidses Bunge，Scutellaraia baicalensis Georgi，R.offiainale Baill had good effect in germinative test.ConclusionCoptis chinensis Franch，Anemarrhena asphodeloidses Bunge，Scutellaraia baicalensis Georgi have good antimicrobial activity on Candida dubliniensis,and have good effect in germinative test.

　　Key words：Chinese herbal medicine；  Candida dubliniensis；  Antimicrobial activity；  Germinative test

　　都柏林念珠菌是1995年由Sullivan等在愛(ài)爾蘭共和國的都柏林大學(xué)報告為一組具有非典型特征的假絲酵母菌，命名為都柏林念珠菌［1，2］，該菌種在人類(lèi)免疫缺陷病毒感染者和艾滋病患者的口腔中分離率高達19％ ～32％，在其他人群口腔中的分離率為3％ ～14．6％［3~5］ ，臨床上觀(guān)察到都柏林念珠菌主要引起免疫缺陷患者的口咽部感染，較少引起其他部位及全身播散性感染［6，7］。目前臨床上仍常用制霉菌素、酮康唑等西藥，有報道出現耐藥性［8~10］。因都柏林念珠菌的培養特性、染色形態(tài)及許多生物學(xué)特性與白念珠菌非常相似，本實(shí)驗選用對白念珠菌具有較好抑菌效果的黃連、知母、七葉一枝花、黃芩、大黃、五倍子［11，12］，采用芽管實(shí)驗法［13，14］、美國國家臨床實(shí)驗室標準化委員會(huì )(NCCLS)M27-A方案［15］和傳統的瓊脂擴散法，綜合比較出黃連、知母、七葉一枝花、黃芩、大黃、五倍子對都柏林假絲酵母菌的抑菌強弱，從而為今后中草藥復方治療都柏林假絲酵母菌性口腔疾患提供理論依據。

　　1  材料

　　1.1  中草藥提取物的制備 取干燥中草藥（均購自贛州市醫藥公司）400 g，加雙蒸水過(guò)液面2 cm，煮沸兩次。30 min/次，合并濾液，濃縮至200 ml。加3倍量50％的乙醇，放冰箱靜置過(guò)夜，次日減壓過(guò)濾，并回收濾液中乙醇，繼續濃縮濾液得無(wú)醇味的提取物。提取物加雙蒸水至100 ml使藥液為相當生藥4 g/ml。置冰箱中備用。

　　1.2  菌株  都柏林念珠菌標準菌株（CCCCMIDC8a），購于南京中國醫學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所。

　　1.3  菌液的制備菌株在沙保葡萄糖瓊脂（Sabouraud dextrose agar）上進(jìn)行傳代培養后用于檢測。分光光度計在530nm處檢測接種菌懸液，調節濃度至1.0×106細胞/ml,稀釋100倍備用。

　　2  方法

　　2.1  瓊脂擴散法用無(wú)菌棉簽沾取菌液在沙氏瓊脂平板上作均勻密集劃線(xiàn)，待菌液干燥后，用外徑5 mm的打孔器打孔，每孔加藥液200 μl，平放在37℃霉菌培養箱中培養35 h，觀(guān)察結果，測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑取兩次實(shí)驗結果的平均值。

　　2.2  肉湯微量稀釋法根據實(shí)驗室標準協(xié)會(huì )（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI,NCCLS）的M27-A標準，采用肉湯微量稀釋法在含2%葡萄糖的RPMI中進(jìn)行抗真菌藥敏檢測。取小號試管8支，編號。第1步每支管各加1ml肉湯培養基，然后在第1管加1 ml藥液，用吸管在第1管吹數次，使藥液與肉湯培養基混勻，取出1 ml加于第2管，混勻取出1ml加于第3管，如此稀釋到第7管棄去1 ml，第8管不加藥液作為對照。第3步每管加菌液50 μl，混勻，置37℃溫箱中培養35 h。然后從每管中取出一接種環(huán)接種于沙氏培養基上，再繼續培養35 h，觀(guān)察結果。MIC定義為導致菌株生長(cháng)被完全抑制的最低藥物濃度。

　　2.3  芽管實(shí)驗法對照管：正常人血清0.5 ml，生理鹽水0.5 ml，菌液0.1 ml；試驗管：正常人血清0.5 ml，試驗藥液0.5 ml，菌液0.1 ml。對照與實(shí)驗管的菌液取自同一管，菌液濃度約為1×108細胞/ml。37℃霉菌箱中培養35 h，壓滴法光鏡400×隨機觀(guān)察數個(gè)視野，細胞數約為80~120個(gè)/視野為合適。結果判定：統計芽管與假菌絲形成的百分率，即壓滴法美蘭染色計數100個(gè)細胞，記錄形成芽管與假菌絲的細胞數。每種藥物觀(guān)察3個(gè)視野，取平均值。

　3  結果

　　3.1  瓊脂擴散法都柏林念珠菌對黃連、知母、七葉一枝花、黃芩比較敏感，其中黃連、知母的體外抑菌效果最好。結果見(jiàn)表1。

　　3.2  肉湯微量稀釋法測定結果見(jiàn)表2。

　　3.3  芽管實(shí)驗法結果見(jiàn)表3。

　　表1  瓊脂擴散法量取的抑菌圈直徑（略）

　　表2  肉湯微量稀釋法測定的MIC范圍（略）

　　表3  芽管實(shí)驗法形成芽管與假菌絲的細胞百分數（略）

　　4  討論

　　越來(lái)越多的研究顯示部分都柏林念珠菌對唑類(lèi)藥物具有劑量依賴(lài)敏感或耐藥。該菌能在體外對氟康唑迅速產(chǎn)生穩定的耐藥性，且這種耐藥性不會(huì )因在不含氟康哇的培養基上傳代丟失［16］。本研究選用的黃連、知母、七葉一枝花、黃芩、大黃、五倍子這6種中草藥都具有清熱解毒，消腫化淤的功效，對白色念珠菌有較好的體外抑菌效果［11,12］，但這些中草藥在抗都柏林念珠菌方面國內外未見(jiàn)文獻報道。本研究顯示黃連、知母、七葉一枝花、黃芩對都柏林念珠菌具有較好的抑菌作用，這些藥物可否組成復方作為治療都柏林念珠菌感染的臨床新選擇，還需做進(jìn)一步的研究。

　　瓊脂擴散實(shí)驗是常用的藥物篩選方法之一，但由于都柏林念珠菌在瓊脂培養基上主要為酵母相，故該法只反映藥物抑制了都柏林念珠菌酵母相的生長(cháng)，而不能反映藥物對都柏林念珠菌菌絲相的影響。為此，本研究將芽管試驗應用于抗都柏林念珠菌中草藥的篩選，其依據是都柏林念珠菌在含有血清的培養基可由酵母相發(fā)育為菌絲相，當加入試驗藥物后，可阻止都柏林念珠菌發(fā)育為芽管或假菌絲，從而能反映藥物對都柏林念珠菌致病物質(zhì)的影響，對藥物的篩選有重要意義。本實(shí)驗結果顯示：黃連、知母、黃芩、大黃抑制出芽效果較好。具體抑制出芽的機理有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗采用出芽實(shí)驗法、肉湯微量稀釋法和傳統的瓊脂擴散法綜合比較黃連、知母、七葉一枝花、黃芩、大黃、五倍子對都柏林念珠菌的體外抗菌活性，結果顯示，黃連、知母、黃芩對都柏林念珠菌具有較好的抑菌效果，且抑制都柏林念珠菌出芽效果也較好。

  作者：王小麗 鐘有添 馬廉蘭《時(shí)珍國醫國藥》

【參考文獻】

  　［1］ Coleman DC,Sullivan DJ,Bennett DE, et al. Candidiasis: the energence of a novel species. Candida dubliniensis［J］.AIDS 1997 , 11(5):557.

　�。�2］ 秦振宇，吳紹熙，譚升順，等.都柏林念珠菌的國內首次分離［J］.臨床皮膚科雜志, 1999,28(4)：213.

　�。�3］ Moran GP,Sullivan DJ,Herman MC, et al. Antifungal drugs susceptibilities of oral Candida dubliniensis isolates from human immunodeficiency virus(HIV)-ifected and non-HIV-ifected subjects and generation of stable fluccnazole-resistant derivatives in vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997,41:617.

　�。�4］ Kim JO，Garofalo L，Blecker-Shelly D,et a1．Candida dubliniensis infections in a pediatric population： retrospective identification from clinical laboratory isolates of Candida albicans［J］Clin Microbio1,2003,41:3354.

　�。�5］ Cardenes-Perera CD，Torres-Lana A，Alonso-Vargas R, et a1．Evaluation of API ID 32C and VITEK-2 to identify Candida dubliniensis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis ,2004,50:219.

　�。�6］ Kibbler CC，Seaton S，Barnes RA，et a1．Management and outcomeof bloodstream infections due to Candida species in England and Wales［J］.Hosp Infect ,2003,54:l8.

　　［7］ Pfaller MA, Diekema DJ. Twelve years of fluconazole in clinical practice：global trends in species distribution and fluconazole susceptibility of bloodtstream isolates of Candida［J］.Clin Microbiol Infect ,2004,l0 (l):11.

　�。�8］ 周正任.醫學(xué)微生物學(xué)，第6版［M］.北京：人民衛生出版社，2003：345.

　�。�9］ 黃文祥，王其南.抗真菌藥物的耐藥性研究進(jìn)展［J］.國外醫藥·抗生素分冊，2003, 24（4）：132.

　�。�10］ 劉洪濤，張軍東，曹永兵.真菌耐藥性研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2003, 38 (5):231.

　�。�11］ 馬廉蘭，鐘有添.六種中草藥對深部感染真菌的體外抑菌效果［J］贛南醫學(xué)院學(xué)報, 2001,21(1):215.

　�。�12］ 馬廉蘭，李坊貞，王小麗，等.黃連與知母對七種念珠菌的體外抗菌作用［J］.中華臨床藥學(xué)雜志, 2002,3(10): 18.

　�。�13］ 章強強.檢測白念珠菌芽管形成的新方法［J］.中華皮膚科雜志,1995,28(6):407.

 　�。�14］ 馬廉蘭，劉志春，王小麗，等.芽管試驗法與瓊脂擴散法同步篩選抗白念珠菌中草藥［J］.贛南醫學(xué)院學(xué)報, 2004, 4(2):361.

　�。�15］ National committee for clinical laboratory standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast;Approved Standard M27-A.Lancaster Avenue,Villanova.Pennsylvania:NCCLS,1997,1.

［16］ Quindos G，et a1．In vitro susceptibility and of Candida dubliniensisto current and new antiungal agents［J］.Chemotherapy，2000,46(6):395.

上一篇：侵襲性肺曲霉菌病的臨床分析

下一篇：培養條件對兩性霉素B抑制白色念珠菌作用的影響