千里光水浸液對大腸埃希菌R質(zhì)粒的消除作用

【摘要】  　　目的探討千里光對大腸埃希菌R質(zhì)粒消除作用。方法對尿路感染患者尿液中分離的大腸埃希菌R質(zhì)粒進(jìn)行檢測，并選用中藥千里光水浸液對該質(zhì)粒進(jìn)行了體外、體內消除實(shí)驗。體外實(shí)驗：千里光水浸液亞抑菌濃度分別作用大腸埃希菌24，48，72 h后，影印培養，計數消除子數；體內實(shí)驗：建立腸道去污染小鼠動(dòng)物模型后，經(jīng)口感染大腸埃希菌，同時(shí)給千里光水浸液，灌胃給藥，每只2 mg/d，分別于給藥后24 ，48，72 h后處死小鼠，分離培養細菌，計數消除子數。消除子經(jīng)質(zhì)粒抽提瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果體外藥物作用24，48，72 h后，R質(zhì)較消除率分別為：0.2%，2.2%，3.8 %；SDS對照組分別為12.1%，14.9%，23.7%，體內藥物作用24，48，72 h R質(zhì)粒消除率分別為0%，3.1%，14.4%，對照組分別為0%，0.1 %，0.1%。結論中藥千里光水浸液對大腸埃希菌R質(zhì)粒于體內、體外均具有消除作用，體內消除作用強于體外。

【關(guān)鍵詞】  千里光 大腸埃希菌 R質(zhì)粒消除

　　Abstract:ObjectiveTo explore the elimination effect of Senecio scandens Buch-Ham (SSB) Liquid Extracts on R plasmid (RP) of Escherichia coil．MethodsRP of E.coil were isolated from the urine of urinary tract infection patients, and the elimination test of SSB extracts on these plasmids was performed in vitro and in vivo. After sub-bacteriostatic concentration of SSB extracts treated E.coil in vitro for 24 h, 48h and 72h. Replica plating and counting of colonies resisting to antibiotics were carried out. Germ-free mice in intestine were orally inoculated with E.coil, then water decoct agent of SSB was given orally in 2 mg/d per mouse, Eliminant of E.coil was identified by replica plating and colony counting after 24 h, 48h and 72 h, respectively．RP eliminated bodies were identified through electrophoresis with agarose gel. ResultsAfter drug acted on E.coil 24 h, 48h and 72h in vitro respectively, elimination rate of RP in SSB tested group were 0.2%, 2.2%, 3.8%, while in control SDS group were 12.1%, 14.9%, 23.7%，respectively; 24 h, 48h, 72h in vivo, elimination rate of RP in test group were 0, 3.1%, 14.4%, and in control group were 0, 0.1%, 0.1%, respectively.　ConclusionSSB has strong function to eliminate RP of E.coil in vivo and in vitro. The eliminative effect is stronger in vivo than in vitro.

　　Key words:Senecio scandens Buch-Ham;   Escherichia coil;   R plasmids;   Elimination

　　大腸埃希菌作為條件致病菌是醫院內感染最常見(jiàn)病原菌之一，其耐藥菌株引起的感染日益增多。細菌的耐藥性由染色體或耐藥質(zhì)粒(R質(zhì)粒)介導，耐藥質(zhì)�？赏ㄟ^(guò)接合、轉化、轉導等方式在不同菌種之間傳遞，使敏感菌成為耐藥株，造成了R質(zhì)粒的流行［1］。影響R質(zhì)粒傳播的因素主要是由于抗生素的濫用，即抗生素的使用起到了選擇作用，使含有R質(zhì)粒的菌株得以生存、擴增。將R質(zhì)粒從宿主菌中消除，使其恢復對抗生素的敏感性，是臨床治療多重耐藥菌感染的新思路［2］。用人工方法消除R質(zhì)粒國內外曾有報道［3］。本實(shí)驗用中藥千里光水浸液作為消除劑，對大腸埃希菌R質(zhì)粒進(jìn)行體內、體外消除實(shí)驗，觀(guān)察千里光對耐藥質(zhì)粒的消除作用，探討其臨床應用的可能性。

　　1  材料

　　1.1  菌株　

　　大腸埃希菌(E.coil)，從贛南醫學(xué)院第一附屬醫院尿路感染患者尿中分離并鑒定為大腸埃希菌。

　　1.2  藥品與試劑　

　　千里光購于江西贛南醫學(xué)院附屬醫院中藥房，取干燥生藥50 g，加適量水煮沸30 min，過(guò)濾，藥渣再加水煮沸30 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，濃縮到50 ml，即得1 g/ml千里光水浸液。營(yíng)養瓊脂為上海醫學(xué)化驗所產(chǎn)品；LB肉湯培養基(每毫升中含蛋白胨1 g，酵母抽提物5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，pH7.2)；十二烷基硫酸鈉(SDS)購于華美生物工程公司；四環(huán)素（TC）、氨芐青霉素(AP)、鏈霉素(SM)均系國產(chǎn)標準品。

　　1.3  動(dòng)物　

　　昆明小鼠30只，6～8周齡，體重18～20g，雌雄不限，由贛南醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物部提供。

　　2  方法

　　2.1  實(shí)驗菌耐藥性測定　

　　以平板稀釋法［4］測定各抗生素對大腸埃希菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。

　　2.2  體外消除實(shí)驗　

　　按文獻［5］方法進(jìn)行。將大腸埃希菌接種于 LB肉湯培養基中，37℃過(guò)夜振蕩培養，調菌液濃度1.5×109cfu/ml。取菌液5 μl分別加入含不同濃度千里光(自100 mg/ml開(kāi)始，倍比稀釋至第7管，第8管不加藥為空白對照管)的LB肉湯培養基中，每管LB培養基總量為1 ml。37℃振蕩培養24，48，72 h后取出，觀(guān)察細菌生長(cháng)現象，判定亞抑菌濃度。從亞抑菌濃度管中取50 μl菌液分別劃線(xiàn)接種于10塊4%瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，待長(cháng)出單個(gè)菌落后，挑取單個(gè)菌落1 000個(gè)，以影印培養法，依次轉接于含TC(20μg/ml)，SM(40 μg/ml)或AP(20 μg/ml)的藥物平板上以及不含藥物的4%營(yíng)養瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，觀(guān)察并記錄結果。挑取在無(wú)藥平板上生長(cháng)而在含藥物平板不長(cháng)的菌落，即初步確定為R質(zhì)粒消除子，再經(jīng)相同抗菌藥物平板復試以后，最后確定為R質(zhì)粒消除子。將搜集到的消除子與原菌液同時(shí)按文獻［6］快速抽提質(zhì)粒DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測質(zhì)粒帶的消失情況。另設SDS陽(yáng)性對照組和空白對照組，消除實(shí)驗方法同上。

　　2.3  體內消除實(shí)驗 

　　2.3.1  建立大腸埃希菌腸道感染的小鼠模型［7］將實(shí)驗用小鼠均置消毒過(guò)的塑料籠內于無(wú)菌箱內飼養。第1天，每只小鼠經(jīng)灌胃法給四環(huán)素5 mg，紅霉素1 mg，8 h后給利福平6 mg。另外，飼以經(jīng)高壓滅菌的飲料塊和含四環(huán)素(0.5 mg/ml)，紅霉素(0.01 mg/ml)的無(wú)菌飲水。第2～3天每只小鼠給利福平6 mg，第4～5天每只小鼠給四環(huán)素2 mg，用大腸埃希菌 (菌液濃度1.5×109 cfu/ml) 0.2 ml/只經(jīng)口感染，飲水和飲料同前。

2.3.2  大腸埃希菌R質(zhì)粒的消除從第6天起將模型小鼠隔離，并隨機分6組，即3個(gè)實(shí)驗組及相應對照組，每組5只。實(shí)驗組灌胃給予千里光水浸液(每只2 mg/d)，對照組不給任何藥物。同時(shí)，所有小鼠均禁食，但給經(jīng)煮沸消毒的含蔗糖(10%)、氯化鈉(0.8%)、碳酸氫鈉(0.10%)的飲水。給藥后分別于24，48，72 h后處死小鼠，取盲腸內容物接種在4%營(yíng)養瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，分離單個(gè)菌落，每組隨機挑取1 000個(gè)菌落影印培養，計數消除子數，再經(jīng)質(zhì)粒抽提，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，步驟同上。

　　2.4  統計學(xué)分析

　　各組實(shí)驗數據釆用SPSS 10.0統計軟件處理，進(jìn)行采用χ2 檢驗。

　　3  結果

　　3.1  大腸埃希菌對抗生素耐藥性檢測結果 

　　TC，SM，AP對大腸埃希菌MIC均>800 μg/ml，呈高度耐藥，千里光對大腸埃希菌MIC為12.5 mg/ml。

　　3.2  體外消除實(shí)驗

　　千里光體外作用大腸埃希菌24 h后，其消除結果與空白對照組比較，無(wú)明顯差異(P>0.05)；體外作用48 h與72 h后，其消除結果與空白對照組比較，有極顯著(zhù)性差異(P<0.01)，表明千里光體外有消除大腸埃希菌R質(zhì)粒作用，但其消除作用低于SDS對照組(P<0.01) 。結果見(jiàn)表1。表1  千里光水浸液作用不同時(shí)間后對大腸埃希菌R質(zhì)粒體外消除的影響（略）

　　3.3  體內消除實(shí)驗 

　　千里光體內作用大腸埃希菌24h，其消除結果與對照組經(jīng)卡方檢驗P>0.05，無(wú)顯著(zhù)性差異； 48 h與72 h消除結果經(jīng)卡方檢驗P<0.01，有極顯著(zhù)性差異，表明千里光體內對大腸埃希菌R質(zhì)粒也有消除作用。結果見(jiàn)表2。表2  千里光水浸液作用不同時(shí)間后對大腸埃希菌R質(zhì)粒體內消除的影響（略）

　　3.4  消除R質(zhì)粒的表型千里光在小鼠體內R質(zhì)粒的消除實(shí)驗中，試驗菌株的耐藥性可表現為單一或多重(二耐以上)耐藥性的丟失，而體外消除實(shí)驗和對照組R質(zhì)粒的丟失表現為單一耐藥性的丟失。

　　3.5  消除子的質(zhì)粒檢測結果　

　　原始株與消除子經(jīng)堿裂解法快速抽提質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察發(fā)現消除子均都丟失1至數條質(zhì)粒帶，表明在千里光作用下，質(zhì)粒被消除。

　　4  討論

　　質(zhì)粒編碼所產(chǎn)生的細菌耐藥性和毒力等問(wèn)題，給人類(lèi)疾病治療帶來(lái)了很大困難，腸道耐藥基因庫的存在是腸道致病性耐藥菌株流行的潛在危險。消除耐藥質(zhì)粒，使耐藥菌株恢復敏感性，對于治療臨床上由耐藥菌導致的感染和阻斷耐藥性和毒力的傳播都有非常重要的意義。

　　質(zhì)粒具有自然丟失與人工消除的特性，但R質(zhì)粒自發(fā)消除很緩慢，其消除頻率為10-2～10-8［8］。自20世紀60年代以來(lái)，人們發(fā)現各種理化因素均可消除R質(zhì)粒，如高溫培養、紫外線(xiàn)照射、電穿孔法、SDS、高溫SDS雙重處理、嗅化乙錠、丫啶橙等可影響R質(zhì)粒消除，抗生素也具有R質(zhì)粒消除作用［3］。R質(zhì)粒消除后細菌的耐藥性也隨之喪失，R質(zhì)粒與染色體突變不同，R質(zhì)粒消除后其耐藥性不再恢復，除非外源R質(zhì)粒再次轉入，但由于這些物理化學(xué)因素對人體均有較強的毒副作用，不便投入臨床應用［3］。中藥屬于天然植物藥，毒副作用小，應用安全。中藥的質(zhì)粒消除研究始于20世紀80年代，1983年徐建國等報道用黃連素消除去污染小鼠體內痢疾桿菌的R因子；1985年陳小英［2］報道用大黃素消除金黃色葡萄球菌的耐藥質(zhì)粒，此后陸續有相關(guān)研究報道，但多為抗菌能力強的清熱解毒或清熱燥濕類(lèi)中藥。本實(shí)驗選用的千里光為對大腸埃希菌具有較強抑制作用的清熱解毒類(lèi)中藥，MIC為12.5 mg/ml，故選其作為消除劑。結果表明：千里光對大腸埃希菌R質(zhì)粒具有消除作用，且體內消除作用強于體外，其可能原因是在體內細菌不僅受到藥物的作用，同時(shí)受到機體的內環(huán)境，特別是免疫因素影響。R質(zhì)粒的消除不僅表現為單一耐藥性的丟失，還表現為多重耐藥性的丟失；消除R質(zhì)粒最佳時(shí)間為體外48 h(P<0.01)，體內72 h (P<0.01)。

中藥千里光在臨床上不但可用于體外，也可用于體內，其抗菌能力的強弱與其對細菌質(zhì)粒消除率的大小之間是否存在相關(guān)性還不清楚，因此有關(guān)千里光水浸液對R質(zhì)粒的消除機制有待進(jìn)一步研究。

   作者：張文平 曹鎬祿 張文書(shū) 黃真 《時(shí)珍國醫國藥》

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