4種黃連生物堿的抑菌作用

【摘要】  　　目的小檗堿，藥根堿，黃連堿和巴馬亭是黃連中4種主要的生物堿，為深入研究4種黃連生物堿成分的抑菌特性差異，本實(shí)驗對它們的抑菌譜和抑菌活性進(jìn)行了實(shí)驗研究。方法以從石柱黃連中提取的4種生物堿為實(shí)驗藥物，采用抑菌圈實(shí)驗法，在2 000 μg/mL藥液濃度下對常見(jiàn)的19種微生物進(jìn)行了藥物敏感性試驗,并通過(guò)比濁法對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）進(jìn)行了檢測。結果4種生物堿成分的敏感菌范圍相同但抑菌活性不同，其中小檗堿的抑菌活性最大,黃連堿和巴馬亭次之，藥根堿最��；4種黃連生物堿對革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制活性大于革蘭氏陰性菌和酵母菌；每種生物堿對耐藥金葡菌（MR）和金葡菌的抑菌能力基本相同。結論4種黃連生物堿均為黃連的抗菌活性成分，抑菌譜相同，但抑菌活性有較大差異；4種黃連生物堿對耐藥金葡菌的耐藥性具有消除作用。

【關(guān)鍵詞】  黃連 小檗堿 藥根堿 巴馬亭 黃連堿 抑菌

　　Abstract:ObjectiveBerberine, jatrorrhizine, palmatine, and coptisine are four leading alkaloids from Coptidis rhizome. To research the characteristics of antimicrobial activity of above alkaloids, the antimicrobial spectrums and abilities of them were determined in this paper.MethodsSensitivities of 19 microorganisms to berberine, jatrorrhizine, palmatine, and coptisine were studied under medicine concentration of 2 000μg/ml by antimicrobial circle experiment and their Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) against 14 sensitive microorganisms were determined by colorimetry in this study. ResultsFour alkaloids from Coptidis rhizome had the same antimicrobial spectrums and different antimicrobial abilities, the antimicrobial activity of berberine was the strongest, coptisine and palmatine was relatively weak and jatrorrhizine was the worst. The antimicrobial abilities of four alkaloids against G+ bacterium were stronger than against G－ bacterium and fungus. The same activity of four alkaloids against Methicitlin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylococcus aureus were observed.ConclusionAll alkaloids tested are antimicrobial activity ingredient of Coptidis rhizome. Four alkaloids almost have the same antimicrobial spectums and have different antimicrobial abilities. All alkaloids tested can dispose the drug resistance of Methicitlin resistant Staphylococcus aureus (MRSA).

　　Key wordsCoptidis rhizome;   Berberine;   Jatrorrhizine;   Palmatine;   Coptisine;   Antimicrobial activity

　　黃連是中醫臨床上的常見(jiàn)抗菌消炎中藥，在臨床上除主要用于治療菌痢、腸炎、腹瀉、胃炎等細菌性胃腸炎疾病。研究表明，黃連中的抗菌消炎的物質(zhì)基礎主要是其中所含的原小檗堿類(lèi)生物堿成分，而小檗堿，藥根堿，黃連堿和巴馬亭是黃連中4種主要的生物堿成分，在分子結構特點(diǎn)上均屬異喹啉類(lèi)生物堿,具季銨基團［1］。為深入研究黃連中不同生物堿成分的抑菌活性差異和拓展黃連生物堿的應用領(lǐng)域，從石柱黃連中提取了小檗堿、藥根堿、黃連堿和巴馬亭，以常見(jiàn)的19種動(dòng)植物病原菌為實(shí)驗菌進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗并對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）進(jìn)行檢測，以期為擴展小檗堿和其它黃連生物堿的應用范圍和臨床用藥提供科學(xué)依據。

　　1  器材

　　實(shí)驗藥物：小檗堿、藥根堿、黃連堿和巴馬亭（由實(shí)驗室從石柱黃連中提取分離制備，HPLC檢測純度均在97%以上）。實(shí)驗菌株：金黃色葡萄球菌 (ATCC25923)，金黃色葡萄球菌耐藥菌（MR），膿腫分枝桿菌，傷寒桿菌，綠膿桿菌，志賀氏痢疾桿菌，克雷伯氏菌，腸炎沙門(mén)菌，巨大芽孢桿菌，枯草桿菌，大腸桿菌變形桿菌，白色葡萄球菌，假絲酵母，白色念珠菌，四聯(lián)球菌，魚(yú)害粘球菌和魚(yú)腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌（實(shí)驗菌株由重慶醫科大學(xué)基礎醫學(xué)院病原微生物教研室和西南大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院微生物教研室提供）。

　　培養基：真菌采用改良沙保氏培養基（配方為：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 ml），魚(yú)病原菌（鮭腎桿菌，魚(yú)害粘球菌和魚(yú)腸型點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌）采用胰蛋白胨醋酸鈉培養基（配方：胰蛋白胨5.0 g， 醋酸鈉2.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏0.2 g，蒸餾水1 000 ml），其它細菌采用普通細菌培養基加減成分進(jìn)行培養。配制時(shí)固體培養基加入1.5%的瓊脂，液體培養基不加。

　　實(shí)驗設備：96微孔板，酶標儀，超凈工作臺，滅菌鍋，恒溫培養箱。

　　2  方法

　　2.1  微生物敏感性實(shí)驗將備選的菌種采用較高濃度的藥液進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗，初步確定3種生物堿對實(shí)驗菌的抑菌作用，為進(jìn)一步研究藥物對敏感菌的抑菌能力提供依據。

　　方法為：①藥液配制及紙片制備：將每種藥液均配制成濃度為2.0 mg/ml的溶液，將直徑6.35 mm的紙片浸泡于藥液，100℃/30  min滅菌，冷卻后置冰箱保存。②菌液制備：將實(shí)驗菌種先接種到斜面活化培養24 h, 膿腫分枝桿菌培養2 d后用滅菌生理鹽水洗下，計數后用液體培養基配成108 cfu/ml的菌液。③抑菌圈試驗：用滅菌后的涂布環(huán)將試驗菌液均勻涂抹于固體瓊脂平板上，每個(gè)平板放上3個(gè)藥物紙片，膿腫分枝桿菌培養2 d，其它實(shí)驗菌培養24 h后觀(guān)察，記錄抑菌環(huán)直經(jīng)。

　　2.2  敏感菌的MIC定量實(shí)驗對3種藥液進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗以后，挑選敏感的菌種，采用液體培養基連續稀釋法培養后檢測每種黃連生物堿對敏感菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512和1∶1024共11個(gè)濃度。②實(shí)驗操作在96微孔板上進(jìn)行，每試驗微孔用移液槍加入液體培養基100 μl，試驗菌液20 μl，藥液120 μl，混勻后置37℃培養，膿腫分枝桿菌培養2 d，其它實(shí)驗菌培養24 h后觀(guān)察。每個(gè)實(shí)驗3個(gè)重復并設立不加實(shí)驗菌的本底對照（120 μl藥液＋120 μl液體培養基）。③采用酶標儀檢測微孔板實(shí)驗菌的生長(cháng)情況，檢測指標為微孔中培養液體系的光密度（OD值），檢測波長(cháng)620 nm。實(shí)驗微孔的OD值減去同濃度的本底對照的OD值即為實(shí)驗微孔的OD凈值。根據OD凈值判定藥物對該實(shí)驗菌的MIC。

　　3  結果與討論

　　3.1  藥物敏感性實(shí)驗表1為黃連中4種生物堿對常見(jiàn)19種微生物藥物敏感性試驗的觀(guān)察結果，從表中可以看出，4種黃連生物堿的敏感菌菌譜除了藥根堿以外其它3種基本相同，從表中數據不難發(fā)現，黃連生物堿類(lèi)對G+菌比對G－菌和真菌的作用更加明顯。表1  黃連生物堿對19種病原菌的藥敏實(shí)驗 （略）

　　3.2  黃連生物堿敏感菌的MIC測定表2為4種黃連生物堿在2 000 μg/ml濃度紙片法條件下篩選出的14種敏感菌的MIC測定結果，從表中數據可知：4種生物堿對同種敏感菌的抑菌能力有一定的差異，總體分析來(lái)看，小檗堿的抑菌作用和抑菌譜似乎更大一些，黃連堿和巴馬亭次之，藥根堿最弱。由于藥物的難溶性而限制進(jìn)一步提高藥物濃度，在表面看來(lái)是抑菌譜的差異實(shí)際上可能是抑菌能力的差異。同時(shí)在試驗中還觀(guān)察到4種生物堿對耐藥金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，小檗堿，黃連堿和巴馬亭對膿腫分枝桿菌具有一定的抑制作用。表2  4種黃連生物堿對敏感菌的MICμg·ml-1（略）

　　小檗堿，黃連堿，巴馬亭和藥根堿是黃連中含量最為豐富的4種生物堿，4種生物堿具有相同的基本分子骨架即原小檗堿類(lèi)生物堿分子骨架和芳型季銨氮結構，4種生物堿均具有相同的異喹啉基本分子骨架，抑菌譜理論上不會(huì )產(chǎn)生較大差異。而Iwasa等［2］報道原小檗堿類(lèi)生物堿的藥效必需結構為7位的芳環(huán)季銨氮結構，4種生物堿在分子結構上的區別在于A(yíng)環(huán)2，3位取代基團和D環(huán)9，10位的取代基團的不同，而在A(yíng)環(huán)和D環(huán)取代基團不同對原小檗堿類(lèi)化合物的抑菌活性會(huì )有增減作用。

   

　　張傳美等［3］發(fā)現黃連復方三黃湯或黃連小檗堿對慶大霉素大腸桿菌具有很好的抑制活性，認為它們能抑制和消除耐藥菌株的抗藥性。本實(shí)驗中4種黃連生物堿對金葡菌和耐藥金葡菌（MR）的MIC基本相同，進(jìn)一步證明了黃連生物堿對耐藥菌株有較好的抑制作用，就此現象進(jìn)行研究具有很高的醫學(xué)價(jià)值。

對原小檗堿類(lèi)化合物藥理作用的深入研究后發(fā)現，該類(lèi)化合物除了具有較強的抗菌消炎作用外，而且還具有降血脂，降血糖，抗腫瘤和抗瘧疾等藥理作用［3～5］。因此，對原小檗堿類(lèi)生物堿藥物化學(xué)的深入研究具有較高的科研價(jià)值。

作者：楊勇 葉小利 李學(xué)  《時(shí)珍國醫國藥》

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