肺炎鏈球菌候選蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性

【摘要】  目的: 評價(jià)酪蛋白裂解酶P(ClpP)作為候選疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎鏈球菌（SPN）中的表達情況. 方法: 以TIGR4型SPN的ClpP基因序列設計引物，分別以12株不同血清型SPN的基因組DNA為模板，對ClpP基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(PCR)擴增、膠回收產(chǎn)物與PMD��18克隆載體連接后進(jìn)行測序，運用生物信息學(xué)方法對其核苷酸及推測的氨基酸序列及抗原性進(jìn)行分析，并利用Western Blot方法檢測12株不同血清型SPN的ClpP蛋白的表達情況. 結果: 12株不同血清型SPN的ClpP基因序列和GenBank數據庫對已公布的TIGR4型SPN的ClpP基因一致性>99.0%，推測的氨基酸序列一致性>99.5%. Western Blot結果顯示anti�睠lpP多克隆抗體與12型SPN的菌體蛋白能夠起交叉反應. 結論: ClpP蛋白在不同型SPN之間同源性高，在不同型SPN菌株中均有表達. ClpP是一個(gè)具有前景的SPN候選蛋白疫苗因子.

【關(guān)鍵詞】  肺炎鏈球菌；ClpP基因；序列分析；抗原性

      0引言

    肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SPN）是引起獲得性肺炎、中耳炎、鼻竇炎的主要病原菌. 隨著(zhù)多重耐藥菌株的不斷發(fā)現，疫苗在預防和控制SPN感染中的作用越來(lái)越重要［1］. SPN根據莢膜可分為90多個(gè)血清型，開(kāi)發(fā)對所有血清型SPN都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前SPN疫苗的發(fā)展方向. 研究發(fā)現的SPN蛋白質(zhì)候選疫苗酪蛋白裂解酶P(caseinolytic protease P, ClpP）是ATP依賴(lài)的絲氨酸蛋白水解酶［2］，其在SPN的生存、致病和入血過(guò)程中起著(zhù)重要的作用［3-4］，針對其靶點(diǎn)的疫苗或抗生素也越來(lái)越顯示出其潛在的價(jià)值. 本研究探討ClpP在不同SPN菌株中的保守性與抗原性，以及在不同血清型SPN中表達情況，旨在為自主開(kāi)發(fā)SPN蛋白疫苗奠定基礎.

    1材料和方法

    1.1材料

    1.1.1菌種與質(zhì)粒12株不同血清型SPN： CMCC(B)31 109(serotype 1)，CMCC(B)31 203(serotype 3)，CMCC(B)31 446(serotype 4)，CMCC(B)31 011(serotype 5)，CMCC(B)31 207(serotype 6B)，CMCC(B)31 507(serotype 7F)，CMCC(B)31 216 (serotype 9V)，CMCC(B)31 614 (serotype 14)，CMCC(B)31 687(serotype 18C)，CMCC(B)31 693(serotype 19F)，CMCC(B)31 759(serotype 23F)（北京中國醫學(xué)細菌保藏管理中心），NCTC7466 (serotype 2，國際通用名為D39)（歐洲國家標準菌種庫）；大腸桿菌DH5a和原核表達系統(含pET32a(+)/ClpP重組質(zhì)粒)E.coli BL21(DE3)(重慶醫科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室)，金黃色葡萄球菌標準菌株(重慶醫科大學(xué)微生物學(xué)教研室)，質(zhì)粒PMD18�睺載體試劑盒(日本TaKaRa公司).

    1.1.2試劑DNA提取試劑盒，凝膠回收試劑盒及日常型質(zhì)粒DNA快速制備試劑盒(上海華舜公司)；限制性?xún)惹忻?SPAN lang=EN-US>EcoRI，SacI，高保真LA Taq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大連寶生物技術(shù)公司)；丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，異丙基�拨陋睤��硫代半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)(美國Sigma公司)；DNA marker(上海生工公司)；Goat�瞐nti�瞞ouse IgG HRP(H+L)和3��二氨基苯聯(lián)胺DAB∶3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris堿(美國BBI公司)；His Bind Column(Ni�睳TA)鎳柱(美國Novagen公司).

    1.1.3儀器熱循環(huán)儀（TMBio�睷ad PCR，美國gene cycle公司）； 電泳儀（Power/PAC200，美國Bio�睷ad公司）.

    1.1.4動(dòng)物BALB/c小鼠，雌性，8~10 wk齡，體質(zhì)量18~20 g（重慶醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心）.

    1.2方法

    1.2.1聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的基因將12株SPN在C+Y培養基中增菌至對數生長(cháng)中后期，按試劑操作說(shuō)明書(shū)分別提取基因組DNA，擴增ClpP的開(kāi)放讀碼框架(591 bp). 上游引物：5′�睠GAATTCATGATTCCTGTAGTTAT��3′，含EcoRI位點(diǎn)；下游引物：5′�睠GAGCTCTTAGTTCAATGAATTGTTG��3′，含SacI位點(diǎn)，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成. 使用La Taq高保真DNA聚合酶，以不同型SPN基因組DNA為模板進(jìn)行擴增. PCR體系: ddH2O 13.7 μL，5×buffer(含Mg2+) 6.0 μL，dNTP(10 mmol/L) 2.4 μL，P1(5 pmol/L) 3 μL，P2(5 pmol/L) 3 μL，SPN DNA 1.5 μL，LA Taq 0.4 μL. 在PCR儀上按下列條件進(jìn)行擴增：95℃預熱5 min后反應30個(gè)周期：94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1 min. 末輪后72℃延伸 5 min. 取5 μL反應產(chǎn)物置10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物.

    1.2.2TA克隆載體的構建與鑒定將回收純化的12個(gè)PCR產(chǎn)物克隆至PMD��18T載體，轉入DH5α感受態(tài)細胞，在Amp+LB平板上培養得到多個(gè)陽(yáng)性克隆，單個(gè)陽(yáng)性克隆細菌經(jīng)增菌后進(jìn)行質(zhì)粒抽提后雙酶切鑒定，并將質(zhì)粒送往重慶醫科大學(xué)感染實(shí)驗室做雙向測序.

    1.2.3序列比對與氨基酸序列預測利用DNAssist軟件，將12個(gè)重組克隆質(zhì)粒雙向測序的結果及預測的氨基酸序列與GenBank數據庫對已公布的TIGR4 SPN全基因組序列進(jìn)行相似性分析.

1.2.4抗原表位預測用抗原表位預測工具ANTIGENIC PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES分析不同血清型SPN ClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸組成.

    1.2.5PET�睠lpP重組載體的誘導表達及純化原核表達系統pET32a(+)/ClpP�睧.coli BL21(DE3)在終濃度1 mmol/L IPTG，37℃，250 r/min條件下誘導目的重組蛋白ClpP的表達. 收集的菌體超聲波碎菌后，采用Ni�睳TA柱純化目的蛋白，以SDS�睵AGE和BioRad凝膠圖像分析系統檢查目的重組蛋白表達與提純效果. 將透析除鹽的純化蛋白溶液經(jīng)Bradford法定量后備用.

    1.2.6anti�睠lpP抗血清的制備稀釋后重組clpP蛋白溶液與等體積的CFA或IFA充分混勻成乳狀，在小鼠腹腔下接種制備好的抗原蛋白. 初次免疫時(shí)小鼠接受含200 μL(含重組蛋白10 μg)的CFA與重組蛋白混合物；小鼠再次與末次免疫時(shí)接受200 μL(含重組蛋白10 μg)的IFA與重組蛋白混合物. 小鼠經(jīng)3次免疫后，分離小鼠血清，并用ELISA法測其anti�睠lpP抗體效價(jià).

    1.2.7Western Blot檢測將12株SPN在C+Y培養基中增菌至對數生長(cháng)中后期（A620 nm 0.5~0.6左右），各取2 mL菌液離心取沉淀. 沉淀用PBS洗3次，用1×上樣buffer處理后，于100℃水浴5 min. 全菌裂解物經(jīng)SDS�睵AGE電泳分離后轉膜. 以anti�睠lpP多克隆抗體為一抗（1∶400)，羊抗鼠HRP�睮gG為二抗（1∶5000），DAB為顯色底物，Western Blot檢測菌體中ClpP蛋白的表達，以金黃色葡萄球菌作為對照.

    2結果

    2.1目的基因PCR產(chǎn)物12株細菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)清晰的擴增條帶，產(chǎn)量高，所有PCR產(chǎn)物的分子大小一致，都位于600 bp左右(圖1).

    2.2TA克隆載體的構建與鑒定將12個(gè)重組克隆質(zhì)粒雙酶切后，經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，于期望位置上出現目的條帶(圖2)，證明ClpP開(kāi)放讀碼框架正確克隆入PMD��18T載體，同時(shí)菌落PCR結果也證明基因克隆正確.

    2.3測序結果與序列比對不同株的ClpP基因編碼區大小與TIGR4菌株中ClpP基因一樣，均為591 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼196個(gè)氨基酸，基因序列一致性超過(guò)99%. 由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，預測的氨基酸序列一致性則為99.5%以上. 經(jīng)生物學(xué)信息軟件分析結果顯示，serotype 4，5，6B 三菌株ClpP氨基酸序列與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列僅存在著(zhù)一個(gè)氨基酸的差異，serotype 1 SPN與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列僅存在著(zhù)兩個(gè)氨基酸的差異，其余血清型與TIGR4菌株ClpP氨基酸序列完全一致.

    2.4抗原表位分析結果12株SPN ClpP蛋白的抗原表位數目相同（分別含7個(gè)抗原表位）并且氨基酸組成及分布完全一致.

    2.5融合蛋白及其anti�睠lpP抗體效價(jià)轉化菌經(jīng)IPTG誘導后，較未誘導菌有一條明顯增粗的蛋白條帶，Mr約為42×103左右，與期望值相符合（ClpP蛋白約為Mr 21×103，再加上Mr 21×103左右的硫氧還蛋白）. 蛋白溶液經(jīng)鎳離子柱親和層析后透析，SDS�睵AGE證明純化產(chǎn)物為單一蛋白，純度達90%. 該蛋白免疫小鼠后用ELISA法測得的血清效價(jià)為1∶68 000（圖3）.

    2.6ClpP蛋白的表達SPN全菌裂解物經(jīng)電泳分離后，與制備的anti�睠lpP血清反應，12型SPN全菌裂解物Mr均在21×103的位置出現特異性反應條帶，而陰性對照未見(jiàn)反應條帶出現(圖4). 提示不同血清型SPN中均有ClpP蛋白抗原的表達.

    3討論

    蛋白疫苗是SPN的第三代疫苗. 目前認為理想的SPN蛋白質(zhì)疫苗的標準應包括:能在細胞壁表達或者以分泌方式表達、在人體內抗原性高、能誘導殺菌的抗體和具有高度的保守性. 隨著(zhù)基因組學(xué)與蛋白組學(xué)的發(fā)展，SPN毒力相關(guān)蛋白候選疫苗不斷地被篩選出來(lái). 但是一些蛋白由于等位基因的變異［5-7］，針對于該蛋白的抗體升高不能識別其等位基因變異的表達產(chǎn)物，從而不能誘導針對不同血清型菌株廣泛的免疫保護. 因此，候選疫苗是否具有誘導高水平、能與不同種類(lèi)的型或亞型菌株起交叉反應的抗體的能力，是很多致力于SPN疫苗的專(zhuān)家不斷尋找高保守蛋白疫苗的原因［8-9］.

    我們要評價(jià)ClpP候選蛋白疫苗的價(jià)值就應考慮其在不同血清型SPN的保守性，并考慮ClpP是否在SPN菌體中表達. 本研究選用分離自不同標本并且在中國比較常見(jiàn)的［10］12株不同血清型SPN進(jìn)行研究，結果發(fā)現，在12株菌中ClpP基因相當保守，其抗原表位氨基酸組成以及分布完全一致，無(wú)抗原位點(diǎn)的突變，而且12株SPN菌體蛋白中都有ClpP蛋白的表達. 我們的結果初步表明：ClpP在不同血清型SPN中高度保守，在不同型菌體中都有表達.

    細胞壁表達的高保守性蛋白是首選的疫苗靶點(diǎn). 目前研究較多的幾個(gè)SPN蛋白質(zhì)疫苗如PspA［11］，PspC［6］和PLY［12］等，PspA和PspC雖在細胞壁表達，但由于等位基因變異，保守性相對較差；PLY雖具有較高的保守性，但在細胞內表達，其抗體難以透過(guò)細胞壁與之結合，疫苗保護效果難以得到保證. 而ClpP在SPN熱休克后從細胞內向細胞壁易位［3］，同時(shí)具有高度的保守性，因此它是SPN很好的疫苗靶點(diǎn)，將其單獨使用或與其他的蛋白疫苗組合使用，可能會(huì )使SPN蛋白疫苗的研究取得突破性進(jìn)展，從而為我們自主開(kāi)發(fā)廣保護范圍的SPN疫苗提供理論基礎.

另外我們也采用了BLAST方法分析了SPN ClpP與鄰近種屬細菌ClpP基因序列的相似性，發(fā)現SPN ClpP與許多其它種屬細菌的ClpP基因序列具有高度的同源性，比如SPN的ClpP與唾液酸鏈球菌ClpP的預測氨基酸序列相似程度為87%~88%，與無(wú)乳鏈球菌ClpP的預測氨基酸序列相似程度為91%~92%. ClpP可能在這些菌屬中存在相同的抗原表位，并可能誘發(fā)交叉反應，這應該引起注意. 總之，在大規模人類(lèi)免疫接種前對這類(lèi)高保守蛋白進(jìn)行徹底的安全性調查，將是非常必要的.

作者：李岱容，曹炬，王虹，吳凱峰，尹一兵《第四軍醫大學(xué)學(xué)報》

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