160株新生兒肺炎克雷伯菌的耐藥性分析

【摘要】  目的  分析我院新生兒科病區產(chǎn)ESBLs、AmpC酶的肺炎克雷伯菌的耐藥情況，指導臨床合理用藥。方法  按CLSI 推薦的超廣譜β內酰胺酶( ESBLs)確證試驗,對肺炎克雷伯菌進(jìn)行ESBLs檢測,并用三維試驗法、三維試驗抑制試驗進(jìn)行AmpC酶檢測。結果  160株肺炎克雷伯菌中,檢到產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌84株，陽(yáng)性率高達52.50%。71株耐頭孢西丁菌株檢到23株產(chǎn)AmpC酶，其中單產(chǎn)AmpC酶5株，產(chǎn)Ampc+ESBLs菌株18株。AmpC酶陽(yáng)性率為14.38%（23/160）。結論  分離自我院新生兒科的肺炎克雷伯菌對β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥嚴重，主要以產(chǎn)ESBLs和（或）AmpC酶為主。給臨床抗感染治療帶來(lái)很大困難，是院內感染的一大隱患。

【關(guān)鍵詞】  超廣譜β-內酰胺酶  AmpC酶  肺炎克雷伯菌  三維試驗  三維抑制試驗

        AmpC酶是繼ESBLs之后,臨床上出現的腸桿菌科細菌的又一重要耐藥機制,肺炎克雷伯菌作為條件致病菌是新生兒感染性肺炎的常見(jiàn)病原菌，也是重要的院內感染病原菌,在醫院感染分離率一直趨于首位。近年來(lái),由于廣譜抗菌藥物的廣泛大量應用,導致這些細菌出現高產(chǎn)AmpC酶菌株。近年來(lái)，編碼AmpC酶的基因已轉移到質(zhì)粒上，并在大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌中出現[1]，易在不同菌種間橫向播散。所以監測和檢測這類(lèi)細菌產(chǎn)ESBLs和AmpC酶的情況,對指導臨床合理使用抗菌藥物以及預防和控制院內感染的發(fā)生具有重要的意義。

        1  材料與方法

        1.1 　材料

        1.1.1 　菌株來(lái)源　肺炎克雷伯菌160株均分離自2008年1月至2008年12月我院新生兒病區患兒呼吸道標本。 

        1.1.2 　一次性培養皿與藥敏紙片　一次性培養皿為鄭州博賽產(chǎn)品；藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品。

        1.1.3   試劑  克拉維酸（中國藥品生物制品檢定所）；鄰氯西林（上海四藥有限公司）。

        1.1.4  質(zhì)控菌株  E.coli ATCC25922，K.pneumoniae ATCC700603，E.cloacae 029，E.cloacae 029M。

        1.2 　方法

        1.2.1 藥敏試驗  按CLSI推薦的K-B紙片法進(jìn)行測定，并按其制定的標準進(jìn)行判讀。

        1.2.2 超廣譜β-內酰胺酶( ESBLs) 檢測  按CLSI推薦的確證試驗測定ESBLs。

        1.2.3 　產(chǎn)AmpC酶菌株初篩  采用K-B法，按照CLSI推薦的方法進(jìn)行[2]，頭孢西丁(30μg/片)抑菌環(huán)直徑≤17mm時(shí)，提示對FOX中介或耐藥為疑產(chǎn)AmpC酶菌株。

        1.2.4   β-內酰胺酶粗提取物的制備  取50μl0.5麥氏單位菌液加入12ml胰蛋白胨肉湯中，35℃恒溫搖床孵育6h,4000r/min，4℃離心20min，棄上清，將沉淀物-70℃反復凍融5次，加入pH 7.0的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液1.2ml混勻，14000r/min，4℃離心20min，取上清液即為酶粗提物，無(wú)菌試驗后-20℃保存。

        1.2.5 　三維試驗  對可疑菌株的酶提取物用頭孢西丁三維試驗方法進(jìn)行AmpC 酶確證。 

        1.2.6 　三維試驗抑制試驗[3]  在涂有E.coli ATCC25922 菌液的M-H平皿中央貼1片30μg頭孢曲松紙片,垂直挖四個(gè)狹縫,分別加入40μl的試驗菌株酶粗提取物、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L鄰氯西林、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L克拉維酸、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L克拉維酸+4μl 2mmol/L鄰氯西林,35℃培養24h,擴大生長(cháng)區域消失為酶抑制實(shí)驗陽(yáng)性。

        2  結果

        2.1  160株肺炎克雷伯菌耐藥現象較為嚴重，對16種抗菌藥物中的13種均出現不同程度的耐藥，其中對青霉素類(lèi)、一代至四代頭孢菌素的耐藥率均超過(guò)60% ，經(jīng)ESBLs確證試驗測定產(chǎn)ESBLs有84株，陽(yáng)性率高達52.50%。對加酶抑制劑的β內酰胺類(lèi)復合制劑舒普深、特治星的敏感率僅為55.06%、56.05%，頭霉素類(lèi)的頭孢西丁敏感率僅為55.63%，應引起臨床重視。尚未出現對碳青酶烯類(lèi)耐藥的肺炎克雷伯菌菌株。轉

2.2 經(jīng)產(chǎn)AmpC酶菌株初篩試驗檢出可疑產(chǎn)AmpC酶細菌71株，經(jīng)頭孢西丁三維試驗方法確證產(chǎn)AmpC酶細菌5株。經(jīng)三維抑制試驗確證單產(chǎn)AmpC酶菌株5株（與三維試驗相符），單產(chǎn)ESBLs菌株84株（與ESBLs紙片確證試驗相符）。同時(shí)產(chǎn)Ampc+ESBLs菌株18株，即產(chǎn)超超廣譜β內酰胺酶(SSBLs)，耐藥情況非常嚴重，對β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物（包括含酶抑制劑的復合制劑）全部耐藥，氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)耐藥率也有所提高，僅碳青酶烯類(lèi)未出現耐藥。

        3  討論

        超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）屬于Bush分類(lèi)2be亞組，分子分類(lèi)中屬于A(yíng)類(lèi)酶，ESBLs是目前腸桿菌科細菌（尤其是肺炎克雷伯菌）對廣譜頭孢菌素產(chǎn)生耐藥的最主要原因，它由質(zhì)粒介導，可使細菌對青霉素和一、二、三、四代頭孢菌素以及單環(huán)菌素耐藥，但對頭霉素、碳青酶烯類(lèi)及酶抑制劑（克拉維酸）敏感。

        AmpCβ內酰胺酶是由革蘭氏陰性桿菌產(chǎn)生的主要由染色體介導的絲氨酸頭孢菌素酶組成的一個(gè)酶家族，屬于Bush分類(lèi)中的Ⅰ組（C類(lèi)），能水解三代頭孢，不被β內酰胺酶抑制劑克拉維酸所抑制。研究表明:β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物頭孢西丁和碳青酶烯抗菌藥物亞胺培南是強有力的AmpC酶誘導劑[4]。如果用頭孢西丁或頭孢西丁聯(lián)合第三代頭孢菌素治療含有ampC基因的腸桿菌科細菌如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌，那么在治療過(guò)程中會(huì )因為AmpC酶的大量產(chǎn)生而導致治療失敗。理論上講，四代頭孢對產(chǎn)AmpC酶菌株敏感，但如果同時(shí)產(chǎn)ESBLs則四代頭孢也將無(wú)效。

        實(shí)驗結果顯示，我院新生兒病區分離出的160株肺炎克雷伯菌耐藥情況十分嚴重，僅對阿米卡星、亞胺培南、美羅培南尚未出現耐藥，其他16種抗菌藥物均出現不同程度的耐藥，其中對新生兒適用的β-內酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥嚴重，一代至四代頭孢菌素耐藥率均超過(guò)60%，舒普深、特治星敏感率也僅有55.06%和56.05%。產(chǎn)超超廣譜β內酰胺酶(SSBLs)的肺炎克雷伯菌檢出率高達11.25%(18/160)，針對這類(lèi)細菌臨床用藥唯有選用亞胺培南、美羅培南，抗菌藥物可選范圍之局限令人擔憂(yōu)。

        由于臨床大量廣泛使用三代頭孢、亞胺培南、美羅培南，在抗菌藥物的選擇壓力下我院新生兒科已篩選出持續高產(chǎn)型AmpC酶菌株，一旦處理不當，將持續在醫院環(huán)境內擴散。如果進(jìn)一步出現質(zhì)粒介導的AmpC酶菌株[5]，則對院內感染將造成嚴重的威脅。因此，規范臨床合理使用高級抗菌藥物的任務(wù)已迫在眉睫�！犊咕�藥物臨床應用指導原則》[6]規定，碳青酶烯類(lèi)藥物不宜用于治療輕癥感染，更不可作為預防用藥。因此臨床對懷疑細菌感染性肺炎的經(jīng)驗性用藥或預防性用藥應盡量避免碳青酶烯類(lèi)的使用。

作者：吳健寧 林潤華 林健《中外健康文摘》

參考資料（略）