噬菌蛭弧菌的分離培養研究

蛭弧菌（Bdellovibro，簡(jiǎn)稱(chēng)BD）是革蘭陰性細菌，并可以通過(guò)裂解其寄生的革蘭陰性細菌維持自身的生長(cháng)發(fā)育[1]。目前，對蛭弧菌的研究主要集中在海水中，對淡水中的研究則很少。本實(shí)驗利用普通蛋白胨培養基和營(yíng)養肉湯兩種培養基，采用描點(diǎn)法[2]、單層培養法[3]及雙層培養法[4]，對淡水環(huán)境中的噬菌蛭弧菌樣品進(jìn)行分離培養，以期找出最適合的培養方法及培養基。

　　1  材料與方法

　　1.1  原料 

　　淡水樣品采自阿哈湖水庫，梯度稀釋至10-3倍。蛋白胨培養基（Pp20）下層板(固體):1 g蛋白胨,15 g瓊脂,1 L蒸餾水；Pp20上層板(半固體):1 g蛋白胨,7 g瓊脂,1 L蒸餾水。營(yíng)養肉湯培養基：蛋白胨5 g，牛肉浸汁3 g，蒸餾水1 L稀釋500倍備用[4]。上層膠：NB×500培養液2 ml，CaCl2·H2O 3.94 mg, MgCl2·6H2O 203.3 mg，瓊脂7 g，加蒸餾水至1 000 ml，調節至pH 8.0；下層膠：NB×500培養液2 ml，CaCl2·H2O 3.94 mg, MgCl2·6H2O 203.3 mg，加蒸餾水至1 000 ml，瓊脂15 g，調節至pH 8.0。宿主菌：副溶血弧菌購于中國科學(xué)院菌種保藏中心。引物：正鏈CAGGCCTAACACATGCAAGTC，負鏈 CGWCACTGAAGGGGCAA[5～7]。94 ℃,4 min,94 ℃,1 min,56 ℃,1 min,72 ℃,1 min,72 ℃,5 min,4 ℃,∞。

　　1.2  方法 

　　描點(diǎn)法:將宿主菌分別涂布在蛋白胨培養基（固體）和營(yíng)養肉湯培養基（下層膠）上，用毛細吸管蘸一下樣品，點(diǎn)樣于在培養基不同位置。單層涂布法：將宿主與樣品混合，搖勻后直接涂布在蛋白胨培養基（固體）和營(yíng)養肉湯培養基（下層膠）上。雙層平板培養法：首先將蛋白胨培養基（固體）和營(yíng)養肉湯培養基（下層膠）倒平板、凝固，將0.5 ml宿主，5 ml樣品和5 ml上層膠充分混合，倒在下層膠上。3種方法點(diǎn)樣后30 ℃培養2～3 d，觀(guān)察噬菌斑的生成并計數。3種培養方法各做3份，分別編號1、2、3。

　　1.3  噬菌蛭弧菌的檢測 

　　收取生成的噬菌斑，用16SrRNA基因特異性探針作引物進(jìn)行PCR擴增，檢測所得的細菌是否噬菌蛭弧菌。

2  結果

　　2.1  噬菌斑 

　　描點(diǎn)法點(diǎn)樣后培養2～3 d，并無(wú)明顯的噬菌斑生成。單層涂布法培養2～3 d后，在營(yíng)養肉湯培養基上看到少數幾個(gè)小噬菌斑生成，噬菌斑形狀不規則（圖1）；而在蛋白胨培養基上未見(jiàn)噬菌斑的生成，雙層培養法蛋白胨培養基上有明顯的、大塊的、圓形和不規則斑點(diǎn)（圖2），在營(yíng)養肉湯的雙層培養基上也可看到有圓形，透明的噬菌斑產(chǎn)生，數量較多（圖3,表1），但小于雙層蛋白胨培養基上的斑塊。表1  3種培養方法生成的噬菌斑數（略）

　　2.2  PCR擴增檢測 

　　用16SrRNA基因特異性探針作引物來(lái)進(jìn)行PCR擴增，發(fā)現在蛋白胨培養及營(yíng)養肉湯單層涂布法所得的斑點(diǎn)中所提取的細菌不能得到擴增條帶，而用營(yíng)養肉湯培養的噬菌斑中可以得到蛭弧菌（圖4）。

　　3  討論

實(shí)驗結果表明，只有用營(yíng)養肉湯雙層培養后的活菌計數才能得到有效數字[8]。用描點(diǎn)法無(wú)法得到噬菌斑，這可能是由于所取樣品量太少，蛭弧菌的濃度太低而無(wú)法形成明顯的噬菌斑。雙層培養法可以有效地分離出蛭弧菌，可能因為雙層培養能給宿主和蛭弧菌一個(gè)更為穩定的生長(cháng)環(huán)境，而且營(yíng)養肉湯培養基的效果更好，可能由于培養基中牛肉浸汁和一些離子存在，不僅能使蛭弧菌得到培養，同時(shí)使宿主菌得到增長(cháng)，為蛭孤菌生長(cháng)提供優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養環(huán)境，故認為營(yíng)養肉湯雙層培養是培養淡水蛭弧菌的最適方法。

作者：曾佳  《貴陽(yáng)醫學(xué)院學(xué)報》

【參考文獻】

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