酵母菌發(fā)酵川烏、附子的初步研究

【摘要】  目的探討酵母菌發(fā)酵對川烏、附子(黑順片)中總生物堿含量的影響。方法采取酵母菌直接發(fā)酵和以面粉為基質(zhì)進(jìn)行酵母菌擴增，之后再與川烏、附子混合兩種發(fā)酵方法，水煎提取、測定總生物堿含量和浸膏得率。結果酵母菌直接發(fā)酵生物堿含量最高，酵母菌+面粉再與川烏、附子混合發(fā)酵后生物堿含量略低，但浸膏得率最高，兩種方法發(fā)酵均高于傳統水提法。結論酵母直接發(fā)酵川烏、附子能明顯提高總生物堿含量和浸膏得率。

【關(guān)鍵詞】  川烏; 附子(黑順片); 酵母發(fā)酵; 總生物堿; 浸膏得率

川烏為毛茛科烏頭屬植物烏頭的干燥主根, 具有祛風(fēng)除濕，散寒止痛的功效，附子為子根，具有回陽(yáng)救逆，助陽(yáng)補火，散寒止痛的作用。川烏、附子兩藥材同源，均為臨床常用品。川烏、附子的主要成分之一生物堿是祛風(fēng)除濕、散寒止痛的有效成分，同時(shí)又是導致中毒的成分，由于烏頭堿致毒事件頻頻發(fā)生，制約了烏頭屬中藥的應用[1],《中國藥典》2005 版規定川烏、草烏的用量減至35 g，以減量減毒，這種做法以療效為代價(jià)換取用藥安全。如何通過(guò)簡(jiǎn)單設備、方便操作、低成本加工保證川烏、附子的療效，同時(shí)又降低其毒副作用，達到減毒增效是現代中藥研究的主要課題之一[2]。發(fā)酵是傳統中藥加工的重要方法之一，發(fā)酵作為一種加工工藝不但改變煎、煮、熬、煉、蒸、浸的傳統工藝，而且使藥效提高、藥性發(fā)生改變，在有毒藥物的研究方面蘊藏著(zhù)極大潛力[3]。為此本研究嘗試以無(wú)毒副作用的酵母菌發(fā)酵川烏、附子，闡明此菌發(fā)酵對附子、川烏中總生物堿含量的影響，為下一步藥效和毒理學(xué)研究提供理論依據。

　　1 材料與儀器

　　1.1 材料制川烏、附子(黑順片)均購自河北安國長(cháng)安藥材行，經(jīng)聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院制藥工程教研組鑒定為正品;安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品;蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品;葡萄糖，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;溴甲酚綠(BCG)試液依照2005年版《中國藥典》配制;烏頭堿對照品，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，批號：11072-200410。

　　1.2 儀器超級潔凈工作箱DL-CJ-2ND(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);立式壓力整齊滅菌器LS-835L型(江陰濱江醫療設備廠(chǎng));新型恒溫振蕩器ZHWY-2102(搖床);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A型(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);烘箱(天津市中環(huán)實(shí)驗電爐有限公司);SHB-95型循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司);RE-52C旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng));DZTW調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器廠(chǎng));HW·SY11-K數顯恒溫水浴鍋(北京市長(cháng)風(fēng)儀器儀表公司);TU-1901雙光速紫外可見(jiàn)分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

　　2 方法與結果

　　2.1 面粉發(fā)酵粉碎川烏、黑順片至1020目，以少量水浸泡川烏、黑順片粉末。取干酵母0.5 g，溫水沖開(kāi)，與10 g面粉混勻，平鋪于培養皿，置29℃恒溫培養箱發(fā)酵23 h，取出，分別與40 g川烏、40 g黑順片、20 g川烏+20 g黑順片粉末混合均勻，平鋪于培養皿，根據預試驗結果培養5 d，藥材表面出現白色和黃色菌落。

　　2.2 酵母菌發(fā)酵YPD液體培養基：蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g于1 000 ml水中。

　　YPD固體培養基：蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g于1 000 ml水中。

　　酵母菌活化培養：固體培養基高壓滅菌后，倒入平板，23 h凝固，待用。用少量無(wú)菌水溶解干酵母成膏狀，挑取膏狀酵母，接種后放入29℃培養箱培養3 d待用。

　　酵母菌擴大培養：挑取已活化的菌體，深入液體培養基中輕輕攪拌，于29℃搖床培養3 d，待用。

　　川烏、黑順片發(fā)酵：無(wú)菌條件下，將活化培養的200 ml酵母菌懸液分別與高壓滅菌的川烏40 g，黑順片40 g，川烏20 g+黑順片20 g，粉末攪拌，根據預試驗放入29℃搖床培養5 d，菌懸液顏色變深。

　　2.3 提取分別取發(fā)酵前后的川烏、黑順片各40 g，川烏20 g+黑順片20 g，用300 ml蒸餾水煮3次，時(shí)間分別為1.5，1，0. 5 h，過(guò)濾，合并濾液,離心，取上清，減壓蒸發(fā)至100 ml。分別取上述濃縮液50 ml，用氨試液調pH=9，之后依次用乙醚25 ，20，15，10 ml萃取4次，上層溶液水浴蒸干，取氯仿共5ml轉移殘渣至分液漏斗，以HCl(0.1 mol/L)5，5，5 ml萃取3次，合并上層液，氨試液調pH=9，再用三氯甲烷10，10，10 ml萃取3次，取下層，水浴蒸干。用0.01 mol/L HCl將殘渣轉移定容至10 ml容量瓶中，進(jìn)行總生物堿檢測。

　　2.4 總生物堿檢測

　　2.4.1 烏頭堿對照品溶液配制精密稱(chēng)取烏頭堿標準品2.53 mg置10ml容量瓶，以0.01 mol/L的鹽酸溶液定容，作為對照品。

　　2.4.2 檢測波長(cháng)確定取一定量的對照品溶液于100 ml分液漏斗中，加入pH=3.50的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液5.0 ml，BCG試液2.0 ml，氯仿10.0 ml，加適量蒸餾水使水相成10 ml，充分振搖均勻，靜置1 h分層。將下層氯仿液放入裝有少量無(wú)水硫酸鈉的10 ml容量瓶中。另取10.0 ml氯仿置100 ml分液漏斗中,同法操作，作為空白對照，于200700 nm波長(cháng)范圍內進(jìn)行光譜掃描。結果表明本品在412.5 nm處有最大吸收峰，在此波長(cháng)下空白對照的干擾比較小。見(jiàn)圖1。

1-樣品;2-標準品;3-陰性樣品

　　圖1 烏頭堿-BCG紫外可見(jiàn)光譜

　　2.4.3 標準曲線(xiàn)的制備精密量取烏頭堿標準溶液，0.4，0.5，0.6 ，0.7，0.8，0.9 ml，分別置于干燥分液漏斗(100 ml)中，加緩沖劑5.0 ml，溴甲酚綠溶液2. 0 ml，蒸餾水定容10.0 ml，搖勻。再精密加入氯仿10.0 ml,充分振搖3 min,靜置1 h后，分取氯仿液至已放入0. 5 g無(wú)水硫酸鈉的試管中,放置0. 5 h。另取10 ml氯仿，置于干燥分液漏斗(100 ml)中,同法操作，作為空白對照。于412.5nm波長(cháng)處進(jìn)行吸光度值測定，繪制標準曲線(xiàn)。烏頭堿標準曲線(xiàn)圖如圖所示。計算得標準曲線(xiàn)方程為: Y=0.002 78X+0.023 14，r=0.999 6。結果表明,在10.1222.77 μg/ml范圍內線(xiàn)性良好。根據標準曲線(xiàn)計算總生物堿含量[4]。

　　2.4.4 穩定性實(shí)驗準確移取對照品溶液0.8 ml，按“2.4.2”項的方法操作，在412.5 nm處，分別在0.5，1.0， 1.5，2.0，2.5和3.0 h測定不同時(shí)間段對照品溶液吸光度，并計算相對標準偏差(RSD=0.79)。見(jiàn)表1。表1 烏頭堿-BCG絡(luò )合物穩定性測定結果

　　2.4.5 重現性實(shí)驗準確移取標準品溶液0.5 ml共6份，按“2.4.2”項的方法操作，于412.5 nm波長(cháng)處測定吸光度值，并計算RSD=3.17%。見(jiàn)表2。

　　2.4.6 加樣回收率實(shí)驗取已知含量的樣品6份，加入含量一定的烏頭堿對照品溶液，按“2.4.2”項，在412.5 nm處測定其吸光度值,計算其加樣回收率，結果表明，該方法的回收率在97.34%100.31%之間，平均回收率為99.27%，RSD=1.16%，表明該方法結果可靠。見(jiàn)表3。

　　2.5 干浸膏含量測定分別取發(fā)酵前后的川烏、黑順片各40 g，川烏20 g+黑順片20 g，用300 ml蒸餾水煮3次，時(shí)間分別為1.5，1，0.5 h，過(guò)濾,合并濾液,離心，取上清，減壓蒸發(fā)至100 ml。按照2005年版《中國藥典》Ⅰ部附錄X.A浸出物測定法，各精密取提取液10 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘3 h，轉移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱(chēng)重，計算干浸膏含量，酵母菌+面粉發(fā)酵浸膏得率最高。見(jiàn)表4。表2 重現性測定結果

　　2.6 川烏和附子中總生物堿含量測定精密量取按“2.3”項下制備的9種提取液，按“2.4.2”項方法，在412.5 nm處測定吸光度，并計算含量。與傳統水煎組比較, 酵母菌+面粉發(fā)酵或酵母菌直接發(fā)酵均能夠增加各組中總生物堿的含量，在各種組合中，酵母菌直接發(fā)酵川烏+附子總生物堿含量最高0.39 mg/g，傳統水煎附子生物堿含量則最低0.20 mg/g;酵母菌直接發(fā)酵川烏、附子、川烏+附子總生物堿含量均增加。在浸膏得率方面酵母菌+面粉發(fā)酵較高(39.5%)。見(jiàn)表4。表4 不同處理對方川烏、附子中總生物堿含量和干浸膏得率的影響

　　3 討論

　　微生物發(fā)酵已成為中藥現代化研究的重要內容之一，利用中草藥發(fā)酵已從單味藥涉及到復方且取得顯著(zhù)成果，成藥片仔癀即是用麝香、牛黃、蛇膽、三七等名貴中藥的微生物發(fā)酵物，為臨床退黃、消腫的良藥[5]。酵母無(wú)毒，生長(cháng)繁殖快，培養基和培養條件簡(jiǎn)單，發(fā)酵能力強，因此本研究以川烏和黑順片為基質(zhì)進(jìn)行酵母菌發(fā)酵，結果表明酵母菌發(fā)酵川烏+附子總生物堿含量(0.39 mg/g)明顯高于其它組合，而兩種發(fā)酵方法均高于未發(fā)酵的對照組，由此推斷，酵母發(fā)酵可使川烏、附子中總生物堿含量增加。微生物可利用中藥材為營(yíng)養進(jìn)行分裂、生長(cháng)、代謝和繁殖，在代謝過(guò)程中分泌蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等幾十種胞外酶進(jìn)入培養基，使細胞破裂，細胞間隙增加，減小細胞壁、細胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對有效成分從胞內向提取介質(zhì)擴散的傳質(zhì)阻力，使有效成分提取率明顯升高[6]。酵母菌直接發(fā)酵上述藥材總生物堿增加顯著(zhù)，可能是因為酵母菌直接以川烏和黑順片中的成分為營(yíng)養源，發(fā)酵充分、完全，而以面粉為基質(zhì)進(jìn)行酵母菌擴增，之后再與川烏、附子混合發(fā)酵后總生物堿含量較酵母菌直接總生物堿含量低，因為酵母菌常生長(cháng)在含糖(或鹽)量較高的環(huán)境中,可優(yōu)先利用面粉中的糖類(lèi)為營(yíng)養[7]，而對藥材的利用率降低，同時(shí)加入面粉會(huì )影響生物堿的溶出，故導致其對川烏和黑順片的利用率相對較低，酵母菌+面粉發(fā)酵組干浸膏得率最高(39.5%)，是否與加入的面粉有關(guān)有待于進(jìn)一步研究，由于除沉過(guò)程對有效成分有影響，因此本研究認為酵母菌直接發(fā)酵程序簡(jiǎn)單、操作方面、總生物堿較高，值得深入研究。

微生物發(fā)酵可使中藥材含量和成分發(fā)生變化，如酵母菌發(fā)酵大黃后，總蒽醌含量略有降低，結合型蒽醌含量降低，但游離型蒽醌含量增加6倍左右[8]。川烏和黑順片中的生物堿-雙酯型二萜類(lèi)生物堿，如烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，既是有效成分，也是毒性成分，雙酯型生物堿經(jīng)轉化可分解成毒性較小的單酯類(lèi)生物堿[9]。本研究酵母發(fā)酵川烏和黑順片總生物堿增加顯著(zhù)，其中雙酯型生物堿與單酯型生物堿的含量變化規律有待于進(jìn)一步研究，如何通過(guò)優(yōu)化工藝達到減毒增效、提高總生物堿含量繼而開(kāi)發(fā)外用止痛劑，將是本研究下一步要解決的問(wèn)題。

作者：葛喜珍 劉潔 蘇建樹(shù)，鄭來(lái)麗，李利輝，趙有璽,田平芳《時(shí)珍國醫國藥》

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