煙曲霉不同菌株致病力差異的研究

錄入時(shí)間:2010-12-29 9:49:54 來(lái)源：中國論文下載中心

【摘要】 目的通過(guò)篩選出致病力最強和最弱的菌株研究煙曲霉的致病機制。方法 SPF級雄性ICR小鼠216只，體重(20±0.5)g。隨機分9組，每組8只（感染組7組，陰性對照組和正常對照組各1組）。其中感染組和陰性對照組小鼠免疫抑制后，分別接種7株煙曲霉的孢子懸液和生理鹽水。正常對照組不注射環(huán)磷酰胺和孢子懸液。每日觀(guān)察小鼠的生存狀態(tài)。對死亡小鼠和處死小鼠的臟器進(jìn)行組織勻漿菌落計數和病理學(xué)檢測。實(shí)驗重復3次。通過(guò)比較生存率、中位生存期、平均體重、組織勻漿菌落計數和組織病理學(xué)變化等來(lái)比較煙曲霉的致病力差異。結果 ①感染組小鼠接種孢子懸液后，體重迅速下降。肺組織病理學(xué)檢測觀(guān)察到組織壞死，菌絲聚集；肺組織勻漿培養得到的菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為煙曲霉。②陰性對照組小鼠體重下降速度較感染組慢，無(wú)死亡；肺組織病理學(xué)檢測未見(jiàn)菌絲侵襲。③通過(guò)比較生存率、中位生存期、組織病理學(xué)變化等指標，從7株煙曲霉中篩選得到致病力最強和最弱的菌株（煙曲霉JLC 50134和JLC 30566）。結論不同煙曲霉菌株間存在致病力的差異。

【關(guān)鍵詞】 致病力；動(dòng)物模型；煙曲霉

　　煙曲霉（Aspergillus fumigatus）感染所致侵襲性肺曲霉�。�IPA）是引起高�；颊撸ㄈ缰行粤＜毎麥p少癥、造血干細胞移植、長(cháng)期高劑量使用激素和血液惡性腫瘤等免疫力低下患者）致死性感染的主要原因。由于IPA的發(fā)病率高、病情進(jìn)展迅速、死亡率高（60%～90%）及缺乏有效的治療藥物〔1～2〕，其相關(guān)研究受到了極大關(guān)注。目前，煙曲霉的致病機制尚不明確，已往的研究多集中在通過(guò)改造單一或幾個(gè)與致病性相關(guān)的基因來(lái)研究菌株的致病機制〔3〕，而通過(guò)比較不同煙曲霉菌株間致病力差異進(jìn)行研究在國內尚未見(jiàn)報道。獲得致病力不同的菌株，可以全面、系統地分析和比較與致病力相關(guān)的諸多因素，對煙曲霉的致病機制以及治療藥物開(kāi)發(fā)等方面的研究非常必要。本研究將通過(guò)評價(jià)生存率、中位生存期、組織病理學(xué)變化等指標，比較7株不同煙曲霉致病力的差異。
　
　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　SPF級ICR小鼠216只，雄性，6周齡，體重(20±0.5)g，由吉林大學(xué)白求恩醫學(xué)院實(shí)驗動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK吉20072003。實(shí)驗過(guò)程中對動(dòng)物處置符合2006年科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗動(dòng)物的指導性意見(jiàn)》〔4〕。煙曲霉共7株，其中，強毒株JLC 50134由日本國立千葉大學(xué)真菌醫學(xué)研究中心饋贈，編號IFM 40808。JLC 30542、JLC 30890、JLC 30859、JLC 30566、JLC 31106及JLC 31753分離自臨床患者和環(huán)境樣本，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后，由吉林大學(xué)真菌研究中心菌種保藏中心(Culture Collection of Jilin University Mycology Research Center)分離并保藏。

　　實(shí)驗用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）購自Difco公司，注射用環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 孢子懸液的制備

　　將煙曲霉接種于PDA斜面培養基上，28℃培養5 d。用含有0.05%吐溫 80的生理鹽水制備一定濃度的孢子懸液。將孢子懸液進(jìn)行連續稀釋后涂布在PDA平板培養基上，28℃培養3 d，進(jìn)行菌落計數，與涂布的孢子懸液濃度進(jìn)行比較，計算孢子活力〔（菌落計數×稀釋倍數）/孢子懸液濃度〕＞90%可進(jìn)行接種〔5〕。

　　1.2.2 接種濃度的確定

　　配制煙曲霉JLC 50134的孢子懸液（濃度：1.0×103～1.0×109 CFU/ml共7個(gè)梯度）感染小鼠，每個(gè)濃度10只，預計選用3 d內導致50%小鼠死亡的孢子懸液濃度作為實(shí)驗接種濃度〔5〕。

　　1.2.3 動(dòng)物的免疫抑制和分組

　　隨機挑選小鼠216只，分9組（感染組7組，陰性對照組和正常對照組各1組），每組8只。飼養于IVC鼠籠中，室溫（24℃～26℃），保持濕度，日照14 h和黑夜10 h交替進(jìn)行，墊料、食物和水滅菌處理。飲水中加入四環(huán)素（1 mg/ml）防止細菌感染，實(shí)驗過(guò)程中不限食水。感染組和陰性對照組第1、4天腹腔注射環(huán)磷酰胺（150 mg/kg）進(jìn)行免疫抑制〔5〕，第5天尾靜脈采血計數外周血白細胞數量，通過(guò)白細胞減少的程度確定小鼠是否受到免疫抑制。

　　1.2.4 實(shí)驗動(dòng)物的接種

　　小鼠通過(guò)吸入乙醚麻醉，使其昏迷超過(guò)1 min，抑制吞咽反射。取30 μl不同濃度或不同菌株的煙曲霉孢子懸液（孢子活力＞90%）滴入一側鼻孔；陰性對照組小鼠進(jìn)行同樣麻醉，接種等量的含有0.05%吐溫80的生理鹽水；正常對照組小鼠不注射孢子懸液和生理鹽水。

　　1.2.5 動(dòng)物感染過(guò)程監測、臟器處理及感染菌株鑒定

　　感染后15 d內，每日觀(guān)察小鼠的生存狀態(tài)，測量體重，計算生存率；取感染死亡小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和肺臟進(jìn)行組織勻漿，稀釋至濃度為1.0×10-3g/ml。取200 μl涂布在PDA平板培養基上，28℃培養3 d，進(jìn)行菌落計數。將臟器剩余部分用10%（v/v）甲醛固定，浸入石蠟，切片，HE染色。15 d后，將仍然存活的小鼠頸椎脫臼法處死，處死小鼠的肝臟、脾臟、腎臟和肺臟的操作同前。將組織勻漿培養得到的菌株，利用小瓊脂塊培養法進(jìn)行初步鑒定。提取菌株DNA，利用真菌通用引物(E1m4和rE2m4)擴增線(xiàn)粒體細胞色素b基因片段〔6〕，并進(jìn)行DNA序列測定。將測定結果與GenBank中煙曲霉序列進(jìn)行比對，以驗證該菌株是否為煙曲霉。以上實(shí)驗重復3次。

　　1.2.6 煙曲霉致病力的比較

　　通過(guò)綜合分析生存率、中位生存期、平均體重、肺組織勻漿的菌落計數及其組織病理學(xué)變化來(lái)比較7株煙曲霉的致病力。

　　1.3 統計學(xué)處理應用SPSS16.0軟件對生存率進(jìn)行Logrank檢驗，對Log (CFU/gram)進(jìn)行方差分析。

　　2 結果

　　2.1 接種濃度的確定

　　接種煙曲霉JLC 50134 共7個(gè)濃度的孢子懸液，生存率計算結果見(jiàn)表1。發(fā)現濃度為1.0×107 CFU/ml時(shí)，在第3天50%的小鼠死亡，確定該濃度為實(shí)驗接種濃度。表1 煙曲霉不同濃度孢子感染小鼠生存率(略)

2.2 小鼠的生存狀態(tài)

　　注射環(huán)磷酰胺前，小鼠外周血白細胞計數為（7.2±0.23 ）×109 CFU/ml，注射環(huán)磷酰胺后第5天，小鼠外周血白細胞計數為（1.5±0.45 ）×109 CFU/ml，證實(shí)小鼠處于免疫抑制狀態(tài)〔7〕。感染組小鼠接種孢子懸液2～3 d后，可見(jiàn)活動(dòng)減少；7～8 d后表現為消瘦、體重急速下降，甚至死亡。陰性對照組小鼠接種等量生理鹽水1～2 d內，活動(dòng)減少，體重稍有下降，2 d后逐漸恢復正常，無(wú)死亡。正常對照組小鼠活動(dòng)良好，體重上升。

　　2.3 小鼠生存率比較

　　JLC 50134感染小鼠的生存率較低，接種后第2天開(kāi)始出現小鼠死亡，第3天時(shí)迅速下降至50%，第4天時(shí)生存率僅為10%，第5天時(shí)生存率為0。而JLC 30566感染小鼠在第5天時(shí)才出現死亡，第6天時(shí)生存率達50%，此后再無(wú)下降。JLC 31106感染小鼠第5天生存率為75%，至第7天時(shí)下降至37.5%，第10天后生存率降至25%。另4株煙曲霉感染小鼠的生存率變化與JLC 31106感染小鼠相似。JLC 50134感染小鼠的中位生存期為4，JLC 30566感染小鼠的中位生存期為6，其他5組均為5。Logrank檢驗結果為χ2=14.288，P<0.05。故可認為7組小鼠總體生存率的差別有統計學(xué)意義，說(shuō)明JLC 50134感染小鼠生存率較低，JLC 30566感染小鼠生存率較高。見(jiàn)圖1。

　　2.4 小鼠平均體重比較

　　7組小鼠感染后平均體重均開(kāi)始下降，JLC 50134感染小鼠平均體重下降的幅度和速度最大，第3～4天1 d內小鼠平均體重下降約8.0 g，此后全部小鼠死亡。說(shuō)明該菌感染造成的病理?yè)p害非常嚴重和迅速。JLC 30566感染小鼠的平均體重下降的幅度和速度最小，在第5～6天時(shí)下降約3.6 g，第7天后逐漸停止下降，隨后稍有上升。說(shuō)明該菌感染造成的病理?yè)p害相對較輕。其他5組的變化介于上述兩者之間，下降幅度最大者1 d內約為4.9 g。陰性對照組僅在接種生理鹽水后的5 d內平均體重下降，隨后逐漸上升，在第9天后逐漸恢復至接種前水平，并不斷上升。見(jiàn)圖2。

　　2.5 小鼠的組織勻漿培養和菌落計數

　　將小鼠肝臟、脾臟、腎臟和肺臟的組織勻漿涂布在培養基上，28℃培養2～3 d。除肺臟出現白色絨毛樣絲狀真菌菌落外，其他臟器均未見(jiàn)有菌生長(cháng)。3 d后菌落呈深綠色粉末狀，背面淡黃褐色。經(jīng)小瓊脂塊培養、乳酸酚棉蘭染色，顯微鏡下可見(jiàn)多呈45°角分支的分生孢子梗，燒瓶狀的頂囊，單層小梗位于頂囊上半部，小梗上可見(jiàn)鏈狀排列的球形分生孢子。結合菌落特征和顯微鏡下形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，初步鑒定為煙曲霉。計數7株菌感染小鼠肺組織勻漿的菌落數量，以Log (CFU/gram)表示，結果見(jiàn)表2。培養至第3天，陰性對照組和正常對照組組織勻漿無(wú)菌生長(cháng)。7個(gè)感染組的組織勻漿菌落計數Log值在2.995 4±0.034 1之間，組間差異無(wú)統計學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明7組間小鼠肺組織勻漿培養得到的菌量一致。表2 7株煙曲霉感染小鼠肺組織勻漿菌落計數（略）

　　2.6 菌株的分子生物學(xué)鑒定

　　利用真菌通用引物擴增得到約420 bp的線(xiàn)粒體細胞色素b基因片段，見(jiàn)圖3。經(jīng)過(guò)DNA序列測定以及序列比對，證實(shí)肺組織中分離得到的菌株是煙曲霉。

　　2.7 小鼠的肺臟組織病理學(xué)觀(guān)察

　　感染組小鼠肺臟組織切片可見(jiàn)致密、有隔、寬度均一（3 ～ 6 μm）的菌絲，放射狀或片狀生長(cháng)。分生孢子梗多呈45°角分支，有時(shí)可見(jiàn)菌絲侵入血管，伴有肺組織的充血、出血和炎癥細胞浸潤。

　　煙曲霉JLC 50134和JLC 30566感染小鼠的組織病理學(xué)變化見(jiàn)圖4。結果顯示，JLC 50134感染小鼠肺組織有出血和充血，大量孢子萌發(fā)成菌絲體（箭頭所示），聚集在血管周?chē)⑶秩虢M織，造成肺泡壁的破壞、炎癥細胞浸潤（圖4a）。JLC 30566感染小鼠可見(jiàn)肺組織結構較為完整，僅有少量出血和炎癥細胞浸潤（圖4b）。通過(guò)比較7株煙曲霉感染小鼠的生存率、平均體重、組織病理學(xué)變化等指標，篩選出了致病力最強的菌株JLC 50134和最弱的菌株JLC 30566。

3 討論

　　煙曲霉是一種腐生菌，在環(huán)境中分布廣泛，且其分生孢子體積微小，極易被人體吸入。若吸入肺泡中的煙曲霉分生孢子逃過(guò)宿主的免疫防御系統，就會(huì )萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，侵入肺組織并血行播散至全身引起感染。由于煙曲霉常侵犯免疫力低下的患者，因此選用環(huán)磷酰胺腹腔注射造成免疫抑制狀態(tài)，以提高小鼠對煙曲霉的敏感性。鑒于煙曲霉造成的IPA多為分生孢子經(jīng)鼻腔吸入肺內所致〔8〕，因此本研究選擇鼻腔接種法進(jìn)行感染，相比氣管內接種更加簡(jiǎn)便快速，對小鼠的傷害較少，能更真實(shí)的模擬感染過(guò)程，并可避免感染過(guò)程中小鼠的意外死亡；此外，該方法容易定量，便于比較不同菌株間致病力的差異。

　　本研究發(fā)現，煙曲霉JLC 50134感染小鼠后，生存率下降最快，造成的病理?yè)p害最為嚴重，而煙曲霉JLC 30566感染小鼠后，生存率下降較慢，病理?yè)p害較輕。說(shuō)明JLC 50134和JLC 30566在致病力上存在顯著(zhù)差異，認為分別是致病力最強和最弱的菌株。目前認為煙曲霉致病機制與很多因素相關(guān)，研究表明雖然宿主呼吸道內的纖毛可以有效地清除一些分生孢子，但是真菌分生孢子侵入宿主肺泡內，黏附于肺泡基底膜是感染的第一步〔9〕。同時(shí)機體的肺泡巨噬細胞在清除分生孢子并阻斷孢子萌發(fā)方面也有一定的作用。Paris等〔10〕發(fā)現煙曲霉黏附因子缺失突變株仍能在肺內定植。而本研究在比較煙曲霉致病力差異時(shí)，發(fā)現組織勻漿的菌落計數無(wú)顯著(zhù)性差異，說(shuō)明這幾株菌的分生孢子能夠黏附并定植于肺組織。這與Paris的研究結果相一致。因此，推斷菌株致病性可能與孢子的萌發(fā)、分泌水解酶和毒性代謝產(chǎn)物等作用相關(guān)。今后致病機制的相關(guān)研究將從這些方面深入細致地開(kāi)展。

作者：張宇宋文剛高嵩劉攀王麗《中國老年學(xué)雜志》

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