食源性病原菌檢測方法研究進(jìn)展

摘要食品中的病原微生物是影響食品安全的主要因素之一,傳統檢測食源性病原菌的方法繁瑣復雜、周期較長(cháng),隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)和微電子技術(shù)等的發(fā)展,快速、簡(jiǎn)便、特異的檢測方法成為研究目標。介紹并分析了幾種檢測食源性病原菌的方法及其特點(diǎn),并就其發(fā)展歷程和應用進(jìn)行闡述。
　　關(guān)鍵詞食源性病原菌;食品安全;檢測方法
　　AbstractPathogenic microorganism is one of the most primary factor which impacts on food safety. The traditional methods for detection of foodborne pathogens are quite complicated,and exhaust a considerable amount of time. With the development of molecular biology and microelectronic technique,the detection technology which is fast,simple and specific becomes the research target. Several methods and feature for detection the foodborne pathogens were introduced and analyzed. Then its developmrent history and application were elaborated.
　　Key wordsfoodborne pathogens;food safety;detection technology
　　
　　農產(chǎn)品和食品安全是全球性問(wèn)題,食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題,世界衛生組織將其定義為:“凡是通過(guò)攝食進(jìn)入人體的,使人體患感染性或中毒性的疾病�！边@里包括了由食品微生物污染和化學(xué)性物質(zhì)引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題。近年來(lái),國內外食源性疾病事件頻頻發(fā)生,如英國的瘋牛病、日本的雪印牛奶金黃色葡萄球菌中毒事件,法國的多起因食用李斯特菌感染的熟肉制品而引發(fā)的食物中毒事件,全世界每年發(fā)生食源性疾病的有數十億人,每年約有200萬(wàn)兒童死于腹瀉。其中66%以上是由細菌性病原菌所致。其中動(dòng)物源性食品中沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、單增李斯特菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要問(wèn)題。因此,對食源性疾病的預防與控制已引起了世界各國關(guān)注。其中,食源性病原微生物的檢測技術(shù)是預防與控制食源性疾病的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節。傳統微生物檢驗方法的最大弱點(diǎn)是耗時(shí)較長(cháng),難以滿(mǎn)足食品生產(chǎn)廠(chǎng)家特別是出口廠(chǎng)家檢測期較短的需求。目前國內外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究,在以抗體和核酸為基礎的檢測方法方面不斷取得進(jìn)展,現將當前國內外實(shí)際應用的食源性病原微生物檢測主要技術(shù)簡(jiǎn)要介紹如下。
　　1以免疫學(xué)反應為基礎的檢測技術(shù)
　　1.1免疫熒光標記
　　1.1.1原理與特點(diǎn)。免疫熒光技術(shù)是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它以熒光素作為一種標記物標記抗體,依據熒光素所發(fā)出的熒光在熒光顯微鏡下對抗原進(jìn)行細胞定位,確定抗原性質(zhì),并利用定量技術(shù)測定含量。該法把血清學(xué)的特異性、熒光色素的敏感性集為一體,因此具有特異性強、敏感性高、速度快的優(yōu)點(diǎn)。主要缺點(diǎn)是非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,使結果判定的客觀(guān)性不足,技術(shù)程序也還比較復雜[1]。
　　1.1.2應用。始創(chuàng )于20世紀40年代初,1942年Coons等首次報道用異氰酸熒光素標記抗體,檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。直至1958年Riggs等合成了性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光素,Marshall等又對熒光抗體標記的方法進(jìn)行了改進(jìn),從而使免疫熒光技術(shù)逐漸推廣應用。1994年我國科學(xué)家孫洋等人成功利用此法檢測沙門(mén)氏菌。
　　1.2酶聯(lián)免疫吸附測定
　　1.2.1原理與特點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附測定是把抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化作用原理結合起來(lái)的一種檢測技術(shù),通過(guò)顯色進(jìn)行定位和定量分析。具有檢測靈敏度高、特異性強、準確性好、樣品處理量大等特點(diǎn),而且可與其他技術(shù)偶聯(lián)而衍生出適用范圍更廣的新方法。
　　1.2.2應用。1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定用于IgG定量測定的文章,使得酶標抗體技術(shù)發(fā)展成液體標本中微量物質(zhì)的測定方法。Kryinski和Heimsch(1977)首次將ELISA用于食品沙門(mén)氏菌的檢測,并在應用中不斷得以發(fā)展,20世紀80年代Paadhye和許多學(xué)者都采用了ELISA進(jìn)行食品沙門(mén)氏菌的檢測,但他們使用的多價(jià)血清不同程度地存在交叉反應,使ELISA產(chǎn)生較多的假陽(yáng)性,在實(shí)踐中有一定的困難。20世紀80年代,單克隆技術(shù)問(wèn)世和日趨成熟,文其乙等人(1995)在前人的基礎上應用沙門(mén)氏菌屬特異性單克隆抗體CB8和DE7建立了檢測沙門(mén)氏菌的直接ELISA方法,并形成了快速檢測試劑盒,已被應用于各種畜禽疾病診斷和環(huán)境樣品的檢測,成為一種常規的檢測方法。但到目前為止,大多數用于直接ELISA的抗體只具有屬特異性。
　　1.3免疫磁珠分離法
　　1.3.1原理與特點(diǎn)。免疫磁性分離技術(shù)是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面,與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性結合,載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下,向磁極方向聚集,棄去檢樣混合液,使致病菌不斷得到分離、濃縮,是從食品成分中分離靶細菌非常有效的方法。若能和其他檢驗方法如ELISA、PCR、FIA相結合,則可數倍地提高分離效率和檢測范圍。
　　1.3.2應用。如利用IMS技術(shù)對環(huán)境水樣本進(jìn)行檢測,不進(jìn)行過(guò)濾等預處理,能快速有效地探測環(huán)境中水的E.coli O157:H7,最低檢測限可達2×103個(gè)細胞/mL;利用IMS-PCR法,可在7 h內在5~100 L樣本中檢測也至少1個(gè)C.parvum卵囊,該方法的快速性和靈敏性足以使其勝任飲用水中C.parvum污染的常規檢測。在英國,此法主要應用于牛奶中E.coli O157:H7的監測和食品中單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小腸結腸耶爾森氏菌等的檢測。

1.4免疫金技術(shù)
　　1.4.1原理與特點(diǎn)。膠體金標記抗體,實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。增菌的陽(yáng)性樣品沿著(zhù)膜移動(dòng),被固定的載有染色劑的抗體將使抗原—抗體復合物著(zhù)色,顯色程度與抗原含量成正比。其特點(diǎn)是靈敏度和特異性都較高,且操作簡(jiǎn)便、快速,無(wú)污染,易于判讀。用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。金標免疫快速試驗的靈敏性與ELISA基本相近,許多試驗的敏感度都可達到1 ng/mL或更低水平,但是有些試驗則不能達到如此的敏感度,采用信號放大系統如生物素—鏈親和素系統,應用鏈親和素與生物素結合的四價(jià)性和極高的親和常數,可明顯提高靈敏度和穩定性[2]。
　　1.4.2應用。1971年Faulk和Taytor將膠體金引入免疫化學(xué),將抗沙門(mén)氏菌抗體與膠體金結合,用直接免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門(mén)氏菌的表面抗原獲得成功。進(jìn)入20世紀90年代,它已在生物醫學(xué)各領(lǐng)域得到日益廣泛的應用。目前有專(zhuān)門(mén)用來(lái)檢測食品及環(huán)境中沙門(mén)氏菌抗原、李斯特菌抗原的商品化檢測卡。
　　2分子生物學(xué)檢測方法
　　聚合酶鏈反應(PCR)是近十多年來(lái)應用最廣的分子生物學(xué)方法,在食源性致病菌的檢測中均是以其遺傳物質(zhì)高度保守的核酸序列設計特異引物進(jìn)行擴增。其大量研究表明,PCR在對食品中病原微生物的確證試驗方面與傳統培養方法相比至少具有相同的靈敏度,而多數情況下則表現出更高的靈敏度,陽(yáng)性檢出率更高[3],而且檢測周期大為縮短。在PCR的不斷發(fā)展和應用中,以其為基礎的更多方法技術(shù)涌現出來(lái),其中,多重PCR、 DNA指紋圖譜技術(shù)、熒光PCR、基因芯片技術(shù)、定量PCR等檢測技術(shù)應用最為廣泛。
　　目前部分常見(jiàn)食源性病原微生物的PCR檢測已有相應的商品試劑盒出售。主要有:BioControl公司的肉毒梭菌、大腸桿菌0157:H7、李斯特菌、沙門(mén)氏菌PCR檢測試劑盒(商品名Probelia)和Qualicon公司的大腸桿菌0157:H7、李斯特菌、沙門(mén)氏菌PCR檢測試劑盒(商品名BAX)等。
　　2.1多重PCR檢測技術(shù)
　　2.1.1原理與特點(diǎn)。多重PCR的建立,實(shí)現了多種食源性致病菌的同時(shí)檢測。多重PCR是指在同一個(gè)反應體系中,加入多對特異性引物,如果存在與各引物對特異性互補的模板,即可同時(shí)在同一反應管中擴增出1條以上的目的DNA片段,達到一次性檢測多種致病菌的目的。多重PCR既保留了常規PCR的特異性、敏感性,又減少了操作步驟及試劑使用量[4]。但也存在明顯的不足,例如擴增效率不高、敏感性偏低;擴增條件需摸索與協(xié)調;可能出現引物間干擾等。
　　2.1.2應用。Franket等[5]首先將多重PCR方法檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌基因�，F多重PCR方法已被用于同步檢測大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、致病性弧菌等[6],鑒定與腸毒素有關(guān)的金黃色葡萄球菌菌株[7],研究李斯特菌種內分化等,結合富集培養,應用多重PCR方法甚至可以同時(shí)檢測13種不同的食源性病原微生物。
　　2.2DNA指紋圖譜技術(shù)
　　2.2.1原理與特點(diǎn)。DNA指紋圖譜是指能夠鑒別生物個(gè)體之間差異的DNA電泳圖譜,使目標微生物的核酸經(jīng)PCR擴增后產(chǎn)生多條DNA擴增片段,這種電泳圖譜多態(tài)性豐富,具有高度的個(gè)體特異性和環(huán)境穩定性。指紋圖譜是鑒別菌種、種屬的有力工具,具有快、準確等優(yōu)點(diǎn)。其中包括隨機引物擴增多態(tài)性DNA分析(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD),主要用于不考慮微生物核酸精確序列的情況下,比較微生物間的DNA指紋圖譜差異,用于細菌種間的鑒定、微生物的分子分型和鑒定。
　　2.2.2應用。國內有的機構采用RAPD技術(shù)對腸炎沙門(mén)菌進(jìn)行分子分型,先將腸炎沙門(mén)菌接種SS平板并取其菌液作為RAPD多態(tài)性分析的DNA粗制模板,然后利用引物5’-CCGCAGCCAA-3’對菌株進(jìn)行RAPD擴增反應并經(jīng)過(guò)凝膠成像系統獲得RAPD圖像,再用軟件計算擴增片段的分子量大小和系統聚類(lèi)分析。該方法為腸炎沙門(mén)菌食源性疾病的流行病學(xué)調查和溯源的同源性分析提供了技術(shù)支持。但是RAPD的不足之處是需對大量的隨機引物進(jìn)行篩選。
　　2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　2.3.1原理與特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應體系中在探針上加入熒光基團,利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍,是迄今為止定量最準確、重現性最好的定量方法,且自動(dòng)化程度高,目前已得到廣泛應用。
　　2.3.2應用。我國科學(xué)家彭雁忠等(2005)已建立了一種能同時(shí)檢測空腸彎曲菌(CJ)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7、副溶血性弧菌(VP)和單核增生李斯特菌(LM)的多聯(lián)實(shí)時(shí)熒光PCR定量方法。
　　2.4DNA芯片技術(shù)
　　2.4.1原理與特點(diǎn)。DNA芯片是將大量寡核苷酸分子固定于固相支持物上組成的微點(diǎn)陣列。其檢測致病菌原理為:選擇細菌的共有基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC)作為靶基因,用1對通用引物進(jìn)行擴增,再利用芯片上的探針檢測不同細菌在該共有基因上的獨特堿基。最后通過(guò)掃描儀定量和分析熒光分布模式區分不同的細菌,此法還可以通過(guò)向寡核苷酸探針陣列中添加相應的探針來(lái)逐步擴大基因芯片的檢測范圍。并通過(guò)增加和調整探針來(lái)逐步提高基因芯片的準確性。在食品衛生質(zhì)量檢驗、臨床疾病診斷方面微陣列基因芯片的開(kāi)發(fā)具有廣闊的應用前景[8]。
　　2.4.2應用。Carl等[9]在對4種細菌,即大腸埃希菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌和空腸彎曲菌采用基因芯片的檢測方法,其檢測結果不僅敏感度高于傳統方法,而且操作簡(jiǎn)單,重復性好,并且節省了大量時(shí)間,大大提高了4種細菌的診斷效率。2001年,Call等[10]利用多重PCR和基因芯片技術(shù)成功檢測了大腸桿菌O157:H7。聶萌(2006)運用通用芯片技術(shù)平臺建立了快速、準確、高通量檢測食源性致病菌的方法。然而,基因芯片技術(shù)還有許多地方待改進(jìn),如檢測成本高昂,檢測特異性有待提高,樣品制備過(guò)程應該進(jìn)一步簡(jiǎn)化以及建立標準化程序等。
　　3生物傳感器
　　3.1原理與特點(diǎn)
　　生物傳感器主要由分子識別的固定化生物敏感膜和轉換信號的換能器2部分組成。當待測物質(zhì)經(jīng)擴散作用進(jìn)入固定化敏感膜時(shí),發(fā)生生物學(xué)反應,產(chǎn)生的信息被相應的轉換器轉變成可定量和可處理的電信號,并經(jīng)儀表放大輸出,以電子計算機處理后,即完成對產(chǎn)生信號的檢測,由此獲得待測物質(zhì)的種類(lèi)及濃度。與傳統的化學(xué)傳感器和離線(xiàn)分析技術(shù)相比,生物傳感器有著(zhù)許多不可比擬的優(yōu)勢,如高選擇性、高靈敏度、較好的穩定性、低成本,可微型化、便于攜帶、可以現場(chǎng)檢測等。
　　3.2應用
　　烏普迪克等(1967)制出了第1個(gè)生物傳感器葡萄糖傳感器。在第2代生物傳感器(微生物、免疫、酶免疫和細胞器傳感器)的基礎上,國內外學(xué)者正研制和開(kāi)發(fā)第3代生物傳感器,是將生物技術(shù)和電子技術(shù)結合起來(lái)的場(chǎng)效應生物傳感器。Liu等[11]用光學(xué)免疫傳感器實(shí)現了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的快速檢測。Geng等[12]采用了以抗體為基礎的光纖免疫傳感器對熱狗和臘腸內少量的單增李斯特菌進(jìn)行檢測,檢測低限為10~1 000 cfu/g,可在24h內完成。在現場(chǎng)快速檢測領(lǐng)域,生物傳感器技術(shù)與比色、免疫膠體金試紙、ELISA等檢測方法相比還未得到普遍應用,但國內外對這方面的報導很多,各種新技術(shù)如納米、分子印跡為其提供了豐富的發(fā)展空間,隨著(zhù)檢測儀器和檢測方法的不斷成熟,生物傳感技術(shù)在食品現場(chǎng)快速檢測領(lǐng)域將有更廣闊的應用前景。

4討論與展望
　　長(cháng)期以來(lái),國內外不少實(shí)驗室對微生物標本的檢測方法做了進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展,但是還是從純培養的觀(guān)念出發(fā),應用各種培養基,進(jìn)行分離培養、形態(tài)檢查、生化反應和動(dòng)物實(shí)驗等,盡管解決了不少問(wèn)題,但其浪費人力、物力,而且需要2~3 d甚至更長(cháng)的時(shí)間才能檢測結果,以致失去了對臨床工作的指導意義,從而不同程度地影響著(zhù)它的使用價(jià)值。為此國內外該領(lǐng)域的研究人員都頗為重視應用免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)和分子遺傳學(xué)技術(shù)與微型計算機相結合或以此為基礎拓展新方法,對細菌等各類(lèi)微生物標本進(jìn)行快速檢驗研究。這樣在檢測標本的過(guò)程中,既無(wú)需進(jìn)行分離微生物或作純培養,也不需要作生化實(shí)驗等,而是應用上述技術(shù)對標本直接做檢測,以確定在標本內是否含有活細菌、細菌產(chǎn)物或抗原成分,定性并定量檢測,而且在2~3 h左右即可報告檢測結果,及時(shí)做出確切診斷。
　　免疫學(xué)方法一般需提供數量較多的純化細菌,或需對樣品進(jìn)行濃縮后收集,以提高單位體積的含菌量,從而較難在短時(shí)間內得到檢測結果。但它不需要復雜儀器,所需設備簡(jiǎn)單、易操作。在測定抗體的試驗中ELISA的陽(yáng)性率與常規方法相似但測出抗體的時(shí)間較早,抗體滴度也較高,但在檢測抗原時(shí),其敏感性尚不能完全令人滿(mǎn)意,說(shuō)明該法還有進(jìn)一步改進(jìn)的必要。其中免疫膠體金快速診斷技術(shù)由于其無(wú)污染、便捷、靈敏、安全等特點(diǎn),對致病菌的檢測研究有廣闊的應用前景。若能實(shí)現多元化,在同一膜上固定多種反應物,1次測定可同時(shí)得到1組結果,這對于檢測某些具有聯(lián)檢意義的物質(zhì)具有很大的應用價(jià)值。但總體來(lái)看,快速檢測方法有時(shí)在衛生檢驗方面目前尚存在定性與精確定量難以兼顧的狀況。另外,每一種免疫學(xué)檢測模式都存在抗體與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應,從而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。此外,待檢抗原被樣品中一些物質(zhì)或其他優(yōu)勢菌群所掩蔽,會(huì )產(chǎn)生假陰性反應。為了避免這些誤差,可設置對照實(shí)驗進(jìn)行證實(shí)。隨著(zhù)分析化學(xué)技術(shù)的發(fā)展,很多儀器分析手段和方法如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)等,已顯示出在微生物檢測中的潛力。這些方法不同于依賴(lài)微生物生物學(xué)特征的檢測方法,而是通過(guò)分析微生物的化學(xué)組成(生物標志物)來(lái)區分和鑒定微生物,開(kāi)辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。

作者：孫曉飛 趙凱 王金斌 譚芙蓉 祁保民 唐雪明《現代農業(yè)科技》
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