黃連、黃芩對3種厭氧菌的體外抑菌活性研究

【摘要】  目的 研究黃連、黃芩對牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌厭氧菌的體外抑菌活性，為臨床篩選中藥治療厭氧菌感染提供依據。方法將黃連、黃芩制成煎劑，采用美國臨床實(shí)驗室標準化委員會(huì )(NCCLS)推薦的瓊脂稀釋法，測定此2種藥物對3種細菌的最小抑菌濃度（MIC）。結果黃連對中間普氏菌的MIC為1∶640；對牙齦紫質(zhì)單胞菌、核梭桿菌的MIC為1∶320。黃芩對牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌的MIC為1∶10；對核梭桿菌的MIC為1∶20。結論 黃連、黃芩對上述3種試驗菌株均具有不同程度的體外抑菌活性，其中黃連對中間普氏菌的抑菌活性最強，黃芩對3種細菌雖然也顯示活性，但均較黃連弱。

【關(guān)鍵詞】  黃連；黃芩；瓊脂；微生物敏感試驗；細菌，厭氧　

　　隨著(zhù)抗生素的大量使用，各種細菌包括厭氧菌的耐藥率日趨升高。資料表明，厭氧菌可以通過(guò)產(chǎn)酶、細胞膜通透性改變、外排、線(xiàn)粒體突變、耐藥基因傳遞等機制導致耐藥率上升，而且長(cháng)期使用抗生素治療還可能誘導菌群失調和真菌的二重感染［1～3］。因此，本研究選擇了3種致病性厭氧菌牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌作為研究對象，采用美國臨床實(shí)驗室標準化委員會(huì )(NCCLS)推薦的瓊脂稀釋法，檢測中藥黃連、黃芩對這3種厭氧菌的體外抑菌活性，以期為臨床應用中藥治療厭氧菌感染提供實(shí)驗依據。

　　1  材料與方法

　　1.1  材  料

　　1.1.1  菌株 

　　牙齦紫質(zhì)單胞菌（Pg ATCC33277）、中間普氏菌（Pi ATCC25611）、核梭桿菌（Fn ATCC10953）均由北京市口腔醫院研究所提供。

　　1.1.2  中藥煎劑的制備

　　稱(chēng)取黃連100 g，加水1～2 L，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，100目篩過(guò)濾。藥渣加水0.5～1 L，按上述方法進(jìn)行再次操作后，過(guò)濾藥液，合并2次濾液，用文火濃縮為100 mL，使藥液濃度為1∶1（每mL藥液含生藥1 g）。用孔徑為0.22 μm的Millex-Gp濾器過(guò)濾除菌，4℃保存備用。同樣制備黃芩煎劑備用。以上兩藥購自河北醫科大學(xué)第四醫院中藥房。

　　1.1.3  試劑 

　　Wilkins-Chalgren厭氧肉湯、Wilkins-Chalgren厭氧瓊脂、M-H瓊脂均購于英國OXOID公司。

　　1.1.4  儀器 

　　比濁儀（美國DADE BERING公司），2.5 L厭氧罐（法國BIOMERIEUX公司），改良2.5 L厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示劑、Millex-GP 濾菌器（日本Nippon Millipore ltd 公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  菌株復蘇及菌懸液制備 

　　用Wilkins Chalgren 厭氧肉湯將牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌分別復蘇，轉種至含5%V/V脫纖維羊血的Wilkins Chalgren 厭氧瓊脂平板上（該瓊脂粉中已含有氯化血紅素和維生素K），置厭氧環(huán)境中（80%N2，10%H2，10%CO2）35℃培養48 h，經(jīng)形態(tài)、生化實(shí)驗鑒定為純培養物后用鹽水制備菌懸液，采用麥氏比濁法用比濁儀調菌懸液濃度達0.5 Mcfarland單位［含 (1～2) ×108 cfu/mL］，稀釋10倍備用。

　　1.2.2  瓊脂稀釋平皿的制備 

　　取9支無(wú)菌試管，第1管加入1 mL黃連煎劑，2～9管加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液，第2管再加入1 mL黃連煎劑，2～9管依次做倍比稀釋。將Wilkins-Chalgren瓊脂融化，置于水浴中平衡置50℃，按5%V/V比例加入脫纖維羊血，無(wú)菌操作吸取9 mL加置上述試管中，混勻傾注7 mL于平皿中。使瓊脂平皿黃連倍比稀釋度分別為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，黃連濃度分別為100、50、25、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 mg/mL。同樣方法制備含黃芩的Wilkins-Chalgren瓊脂平皿。同時(shí)設不加中藥平皿為生長(cháng)對照。

　　1.2.3  接種瓊脂稀釋平皿 

　　用微量多點(diǎn)接種儀將制備好的牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌懸液分別點(diǎn)種1 μL于含不同濃度的黃連、黃芩的Wilkins-Chalgren瓊脂平皿上，置厭氧環(huán)境中，35℃培養48 h。

1.2.4  黃連、黃芩對3種細菌最小抑菌濃度（MIC）的判定
 
　　判讀黃連、黃芩能夠完全抑制細菌生長(cháng)的最低藥液濃度為該中藥對細菌的最低抑菌濃度，即藥物最高稀釋度平皿上無(wú)菌落生長(cháng)者，為該藥對該細菌的MIC［4］。

　　2  結  果

　　2.1  黃連對牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌的MIC分別是1∶320（3.13 mg/mL）、1∶640（1.56 mg/mL）、1∶320（3.13 mg/mL）。

　　2.2  黃芩對牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌的MIC分別是1∶10（100 mg/mL）、1∶10（100 mg/mL）、1∶20（50 mg/mL）。

　　2.3  中藥黃連、黃芩對牙齦紫質(zhì)單胞菌、中間普氏菌、核梭桿菌3種厭氧菌均有不同程度的抑菌能力。其中黃連對中間普氏菌抑菌能力最明顯，比對牙齦紫質(zhì)單胞菌、核梭桿菌高1個(gè)倍比稀釋度；黃芩對3種細菌也顯示了抑菌能力，但都是在比較高的濃度情況下才有抑菌作用，且抑菌能力均低于黃連。

　　3  討  論

　　3.1  中藥抑菌作用機制 

　　黃連主要的抑菌成分是小檗堿，資料表明小檗堿能抑制酵母和細菌糖代謝中間環(huán)節丙酮酸的氧化脫羧過(guò)程，較大濃度時(shí)可顯示對核酸前體摻入的抑制作用，其抑制細菌核酸合成作用在一定濃度范圍內隨藥物濃度增大而增強［5］。黃酮類(lèi)衍生物是黃芩的主要抑菌成分，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效。其有效成分可通過(guò)阻斷細菌的信號通訊通路，降解細菌的內毒素及其破壞細菌細胞生物膜等機制抑制金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌等多種細菌的作用，具有較廣泛的抗菌譜［6］。

　　3.2  我們采用2001年美國NCCLS推薦的瓊脂稀釋法研究了黃連和黃芩對牙齦紫質(zhì)單胞菌、 中間普氏菌、 核梭桿菌的抑制能力，黃連對這3種細菌抑制作用較強，黃芩較弱。黃芩MIC范圍在10～50 mg/mL，與其他研究結論不一致，可能與不同的研究方法有關(guān)，有觀(guān)點(diǎn)認為不同的方法得出的結果存在差異［7］，建議臨床試驗室應采用標準化的實(shí)驗方法，以達到研究結果的一致性。

3.3  隨著(zhù)檢驗技術(shù)的提高，厭氧菌感染的檢出率不斷增加。而厭氧菌對臨床常用的氨基糖苷類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物天然耐藥；厭氧菌也可通過(guò)誘導產(chǎn)酶、基因突變等機制導致對β-內酰胺抗生素高水平耐藥［8，9］，給厭氧菌感染治療帶來(lái)難度。而中藥具有資源豐富、價(jià)廉易得、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，因此篩選有效的中藥對治療厭氧菌感染具有很大的臨床意義。本實(shí)驗旨在通過(guò)采用標準化的實(shí)驗方法，為臨床應用中藥治療該類(lèi)細菌感染提供準確的試驗依據。

 作者：郭秀娟 鄭金秀 李宏 《河北中醫》

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