肺炎鏈球菌莢膜缺陷菌株的構建及功能研究

【Abstract】AIM：To construct galU-deletion mutant of streptococcus pneumoniae and get the capsule deficient strain, which can be used in pneumococcal functional genome research. METHODS:  LFHPCR was introduced to generate a gene disruption construct consisting of Emr cassette with long flanking homology regions to the target gene. The streptococcus pneumoniae was then transformed directly with this PCR product. The galUdeletion mutant was obtained on the TSA agar containing erythromycin and identified by PCR. The deficient strain (5×106 CFU) was applied to infect BALB/c mice to determine the virulence. RESULTS:  GalU gene was replaced completely by erm cassette. The mutant had low virulence to BALB/c mice. CONCLUSION:  The galUdeletion mutant can be used to screen in vivopromoter in streptococcus pneumoniae because it is incapable of synthesizing capsular polysaccharide and hence loses virulence. The target gene can be replaced completely by LFHPCR product, so this method is simple, rapid and effective for functional genome research of streptococcus pneumoniae.

　　【Keywords】  streptococcus pneumoniae；polysaccharides ,bacterial；mutation；polymerase chain reaction

　　【摘要】目的：  galU基因是肺炎鏈球菌莢膜合成的關(guān)鍵基因，構建該基因的缺失突變體，獲得肺炎鏈球菌莢膜缺陷菌株，研究其生物學(xué)功能，并為肺炎鏈球菌功能基因組研究提供實(shí)驗菌株和技術(shù)平臺. 方法： 采用長(cháng)臂同源多聚酶鏈式反應（LFHPCR）方法制備中間為紅霉素耐藥基因（erm），兩側為galU基因上、下游同源序列的連接片段，并將此片段轉化入肺炎鏈球菌，在含紅霉素的血平板上篩選出缺陷菌株.用PCR鑒定缺陷菌株，小鼠實(shí)驗研究其毒力.結果： PCR結果顯示galU基因完全被erm基因所替代，小鼠毒力實(shí)驗表明缺陷菌株毒力顯著(zhù)下降.結論： galU缺失突變體在小鼠體內不能形成莢膜導致其難以在小鼠體內存活，可作為篩選肺炎鏈球菌體內誘導啟動(dòng)子的宿主菌.用LFHPCR作基因突變，可完全替代靶基因，簡(jiǎn)便、快速，是肺炎鏈球菌功能基因組研究的一種有效的方法.

　　【關(guān)鍵詞】 鏈球菌，肺炎；多糖類(lèi)，細菌；突變；聚合酶鏈反應

　　0引言

　　肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae,S.pn）是一種常見(jiàn)的條件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血癥、腦膜炎等嚴重疾病.莢膜多糖的合成是一個(gè)多基因參與的過(guò)程，S.pn染色體上有關(guān)莢膜合成的基因位于dexB 和 aliA 基因的之間，形成操縱子結構（cap operon），參與型特異性莢膜的合成（據此可將S.pn分為90多個(gè)血清型），但是在莢膜操縱子外還存在一些基因對莢膜的合成非常重要［1］.有研究表明在所有S.pn中都存在galU基因，其編碼的UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG：PP）是莢膜多糖生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶［2］.研究證實(shí)肺炎鏈球菌galU基因不是細菌生存所必需的基因［3］，為可以成功構建其突變株提供了理論依據.基因缺失技術(shù)是目前研究基因功能的最佳方法，這里我們采用基于LFHPCR（long flanking homology polymerase chain reaction）方法失活肺炎鏈球菌galU基因，從而獲得S.pn莢膜缺陷菌株，并對該突變株進(jìn)行初步的研究.

　　1材料和方法

　　11材料

　　S.pn血清3型CMCC 31203購自中國藥品生物制品檢定所醫學(xué)微生物菌種保存中心.培養基： C+Y半合成培養基，含5 g/L Yeast提取物（lacks and hotchkiss，1960）；TSA血平板，含50 mL/L兔脫纖維全血.雌性BALB/c小鼠，體質(zhì)量18~22 g，購自第三軍醫大學(xué)動(dòng)物中心.S.pn CPM8染色體DNA（含有紅霉素抗性基因erm）、感受肽刺激肽（CSP），由美國Morrison DA教授惠贈.膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司.PCR試劑購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司.引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：
Primer〖〗Sequence 5′3′P1〖〗GTTGAAACTGCTGGTGCTCTTAAP2〖〗TGCTTTCACTTTATTATCTTGGP3〖〗ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGTCCGTGATAAATAACTTGGTAAP4〖〗TCGTTAAGGGATCAACTTTGGGATTTTCTTTCAACTTCGTCACATDAM212〖〗CCGGGCCCAAAATTTGTTTGATDAM213〖〗AGTCGGCAGCGACTCATAGAATGP1〖〗CCCTCTAGAGAAAGGATTTTTATGAGP2〖〗TTTGGATCCTTATCTTTTTATTTTATTC

　　12方法

　　121S.pn 31203菌株制備按S.pn基因組DNA經(jīng)典提取方法［4］制備： S.pn 31203菌株基因組DNA.

　　122連接片段的制備首先用PCR分別擴增出galU基因的上（P1，P3）、下游片段（P4，P2）和erm基因，引物P3、P4分別帶有22~23個(gè)與erm基因5′，3′端兩側互補的堿基，這樣擴增出的上、下游片段就分別帶有一段與erm基因互補的序列；膠回收3個(gè)片段，并定量；再通過(guò)PCR用外側引物（P1，P2）將這3個(gè)片段連接起來(lái).膠回收連接片段，一份用于轉化，一份送生工測序部測序.

　　123S.pn實(shí)驗室轉化取-70℃保存的31203菌株500 μL培養于CTM培養基（10 mL C+Y中含1 mmol/L的CaCl2和2 g/L BSA）中，當細菌達到一定菌密度時(shí)（A550nm=009），加入CSP和連接片段，37℃孵育90 min，然后鋪于含紅霉素（025 mg/L）的TSA上，37℃孵箱培養24～48 h，挑取血平板上的轉化菌落，于含紅霉素（025 mg/L）的C+Y中增菌，保存并提取DNA.

　　124缺陷菌株的PCR鑒定分別以203野生菌株、galU缺陷菌株染色體DNA為模板，PCR擴增galU基因（GP1，GP2）和erm基因（DAM212，DAM213）l

　　125缺陷菌株的生長(cháng)分別挑取野生菌和缺陷菌的單個(gè)菌落接種于C+Y培養基中，37℃培養12 h，轉接于20 mL C+Y培養基中，37℃培養，定時(shí)測定A620nm的吸光度.以吸光度為縱坐標，時(shí)間為橫坐標繪制細菌的生長(cháng)曲線(xiàn).

126小鼠毒力實(shí)驗將S.pn培養于C+Y培養基中，到其A620nm>05，然后用無(wú)菌PBS稀釋成5×1010CFU/L，分別在BALB/c小鼠的腹腔內注入01 mL菌液，每12~13只為1組，1組注射野生菌株（13只），另1組注射缺陷菌株（12只），記錄小鼠死亡時(shí)間，可得到半數致死時(shí)間.

　　2結果

　　21PCR擴增3個(gè)片段（Fig 1）galUUP（462 bp），galUDW（490 bp），erm（780 bp）.LFHPCR連接3個(gè)片段（Fig  2）： UPermDW（約1700 bp）.測序結果顯示3個(gè)片段連接正確.

　　22galU基因缺陷菌株的PCR鑒定缺陷菌株含erm基因（780 bp）而野生菌株無(wú)erm基因；缺陷菌株galU基因缺失，野生菌株galU基因為892 bp（Fig 3）.

　　23缺陷菌株的生長(cháng)液體培養基中缺陷菌株與野生株的生長(cháng)趨勢基本一致（Fig 4），表明galU基因缺陷后未明顯影響細菌的生長(cháng).但缺陷菌株在體外的生長(cháng)方式與野生株有所不同： 在TSA血平板上為粗糙菌落，而野生株為光滑菌落；在液體培養基中呈沉淀生長(cháng)，而野生株呈懸浮生長(cháng).

　　25小鼠毒力實(shí)驗野生菌株半數致死時(shí)間為15 d，而缺陷菌株在處理后2 wk未見(jiàn)發(fā)病死亡,半數致死時(shí)間>14 d（Fig 5）.

　　3討論

　　莢膜多糖是S.pn主要的毒力因子，失去莢膜的菌株毒力可下降105倍 ［5］.而galU基因作為莢膜多糖生物合成的關(guān)鍵基因，缺失突變后在體內不能形成莢膜，容易被體內免疫細胞清除，該實(shí)驗組的小鼠均無(wú)發(fā)病死亡，證實(shí)其毒力顯著(zhù)下降.同時(shí)對注射野生菌的發(fā)病小鼠腹腔印片鏡檢發(fā)現大量有寬大莢膜的S.pn，而缺陷株鏡檢結果顯示腹腔有大量吞噬細胞聚集，S.pn已被清除.對小鼠血培養結果顯示，經(jīng)腹腔注射的野生菌可入血引起菌血癥，缺陷株則失去入血能力.利用該突變體在小鼠體內不能存活，不能入血的特性為我們接下來(lái)應用體內表達技術(shù)（in vivo expression technology,IVET）來(lái)篩選S.pn體內誘導啟動(dòng)子提供了實(shí)驗菌株.即把它作為宿主菌，用無(wú)啟動(dòng)子的galU基因報告體內誘導的啟動(dòng)子.

替代失活則是構建兩側為目的基因同源序列，中間為耐藥基因的斷裂片段，轉化宿主菌，通過(guò)同源重組，使目的基因完全被耐藥基因替代掉.經(jīng)典的基因替代策略需要將靶基因上、下游同源序列和耐藥基因依次克隆到質(zhì)粒上，構建同源重組載體，再轉化宿主菌.由于酶切位點(diǎn)的存在可能對同源重組效率有一定的影響，為了提高重組效率，有時(shí)還要將載體線(xiàn)形化 ［6］，采用PCR的方法制備斷裂基因片段是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種基因替代失活的有效方法.根據兩側同源序列的長(cháng)短不同有SFHPCR（short flanking homolology polymerase chain reaction）和LFH-PCR兩種策略，SFHPCR產(chǎn)物僅含40~45 bp的同源序列，而LFHPCR產(chǎn)物的同源序列>250 bp，有的甚至達到1500 bp［7］，因此LFHPCR產(chǎn)物的同源整合幾率比SFHPCR高［8］.實(shí)驗中我們發(fā)現耐藥基因與兩側片段的長(cháng)度比例對于轉化效率有影響，我們采用紅霉素耐藥基因（約780 bp）作為替代基因的轉化率比用四環(huán)素耐藥基因（tet，約1500 bp）要高，而且替代的靶基因不同，同源重組的效率有差異.在可發(fā)生自然轉化的幾種細菌中，S.pn的轉化效率最高，我們研究小組已建立起S.pn穩定的實(shí)驗室轉化模型［9］，利用LFHPCR策略可方便地構建目的基因的缺失突變體，galU缺陷菌株的構建成功為進(jìn)一步研究S.pn致病基因的功能奠定了良好的基礎.

作者：孟江萍，尹一兵，袁軍，張雪梅，藍鍇，陳淑惠，王虹，涂植光

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