細菌鞭毛染色的方法

目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為堿性復紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類(lèi)，前5類(lèi)方法的媒染劑成分中均含有單寧酸，染色原理通常是采用不穩定的膠體溶液做媒染劑，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛腫脹（tar and feather）”，鞭毛直徑加粗，進(jìn)一步染色后即可在油鏡下觀(guān)察。
1. 堿性復紅法和副品紅法：1926年由Gray首創(chuàng )，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%堿性復紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過(guò)濾后方可使用。染片時(shí)，媒染劑染色約6min，具體時(shí)間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸復紅染液，染片時(shí)需要1小片吸水紙蓋在涂片上，染色3min。由于該方法媒染劑混合物不穩定、操作復雜、經(jīng)驗性強。Leifson于1930年建立了副品紅法，并于1938年和1951年兩次對該方法進(jìn)行了改良，稱(chēng)為L(cháng)eifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用時(shí)把等體積A和B混合，然后再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個(gè)月。

2. 結晶紫法：又稱(chēng)Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進(jìn)行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶于100 ml無(wú)水乙醇中。使用時(shí)把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片技術(shù)進(jìn)行鞭毛染色，雖然可以觀(guān)察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優(yōu)點(diǎn)是試劑比較穩定，目前Difco公司已經(jīng)研制出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.
3. 維多利亞藍B法：1990年由Inoue等報道日本制藥株式會(huì )社Shionogi Seiyaku研制出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑保存期約為6個(gè)月，關(guān)于其染色效果雖然有過(guò)一篇文獻評述，但卻沒(méi)有采用評分法進(jìn)行評價(jià)，很難判斷其染色效果。
4. 鍍銀染色法：1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉淀，通過(guò)搖動(dòng)又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min后使用。銀染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉淀剛好重新溶解，最后把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動(dòng)后呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光保存，可穩定數周。用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌后，再把銀染液滴加至涂片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。由于Rhodes鍍銀染色法媒染液成分復雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，并用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。由于以上兩種鍍銀染色方法都要使用營(yíng)養瓊脂斜面培養物，并且需用無(wú)菌蒸餾水懸浮菌液制片，未采用評分法評價(jià)鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進(jìn)一步改良，制備涂片時(shí)直接使用血平板，評價(jià)染色效果首次使用5分制，通過(guò)該評價(jià)方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，銀染液滴加至涂片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時(shí)West等還對使用不同培養基進(jìn)行染色效果評價(jià)，包括半固體動(dòng)力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固體動(dòng)力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價(jià)結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適于細菌鞭毛染色，而半固體動(dòng)力培養基和TSA斜面25℃，培養18～24h適合于細菌鞭毛染色，同時(shí)也證明了使用福爾馬林處理標本制備涂片并不能有效阻止鞭毛脫落。由于鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃保存，1992年P(guān)orter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，只是媒染劑避光室溫可保存數月，延長(cháng)媒染劑染色時(shí)間為8 min，染色液不需加熱，只染30 s，制備涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等只使用了1種細菌（奇異變形桿菌）進(jìn)行研究。于是1994年Finegan等進(jìn)一步證實(shí)使用過(guò)期媒染劑進(jìn)行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，并使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形桿菌、黏質(zhì)沙雷菌、枯草芽孢桿菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周后進(jìn)行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。
5、鞭毛的負染：具體操作：菌懸液，直接滴在銅網(wǎng)上，1－2分鐘后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶液，1分鐘后，吸去多余的染液，然后就可以在電鏡下觀(guān)察了。一般染色后十五天之內看電鏡。時(shí)間太長(cháng)效果不好。這是我試驗用的方法。
6、我喜歡用銀染法，曾做過(guò)一段時(shí)間的細菌鑒定，以下是我一些染色心得：首先染色用玻片一定要干凈，洗液泡過(guò)之后蒸餾水沖洗干凈。涂片的時(shí)候菌千萬(wàn)別涂得太多。第一部染色時(shí)，可將玻片置于水浴鍋內，溫度保持在35度,蓋上蓋（主要是保持一定的濕度，防止染色液變干不利于沖洗，這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液沖洗干凈，否則影響染色效果，背景可能非常 臟。其他的步驟參考書(shū)上的資料進(jìn)行，一般沒(méi)什么問(wèn)題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。

注意事項：
1. 要注意培養條件和培養時(shí)間：①用點(diǎn)接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固體平板上接種。一般一個(gè)平板點(diǎn)接3～4處。經(jīng)比較用半固體培養基培養出來(lái)的菌體活動(dòng)度大，鞭毛長(cháng)且多，易于染色，這可能與半固體培養基更適于菌體運動(dòng)、鞭毛生長(cháng)較好有關(guān)。用點(diǎn)接種法在平板上接種更易于挑取邊緣幼齡的菌體。②培養時(shí)間要嚴格掌握，一般培養9～12h較好，菌齡超過(guò)15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動(dòng)度降低、鞭毛易脫落有關(guān)。

2.染色過(guò)程中的細節也應充分注意：①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。②取菌后的接種環(huán)在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環(huán)大幅度涂開(kāi)；將載片稍?xún)A斜，使菌液散開(kāi)即可，否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用熱風(fēng)吹干，不能熱固定，這是由于加熱后菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀(guān)察。④A染液染3～5 min，其后用蒸餾水（自來(lái)水效果差）沖洗時(shí)一定要充分，否則加B染液后，背景很臟，鞭毛不易被觀(guān)察到，影響實(shí)驗效果。⑤加B染液后，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60 s，染色效果較不加熱為好。⑥B染液染完后，用蒸餾水沖洗比用自來(lái)水沖洗效果好。