建立一種糞便細菌學(xué)檢驗的新方法---腸道菌譜分析

[摘要］目的 建立一種以糞便標本細菌菌譜分析為主要內容的細菌學(xué)檢驗方法。方法 取糞便標本直接涂片做革蘭染色，鏡檢觀(guān)察標本中細菌數量、種類(lèi)及比例，并進(jìn)行顯微照相；對糞便標本進(jìn)行菌群培養，分離病原菌，并與鏡檢結果進(jìn)行對照；將照片進(jìn)行分類(lèi)，建立菌群失調和病原菌感染的圖譜。同時(shí)以正常大便菌譜作對照。結果 因菌群失調導致的腹瀉，直接鏡檢表現為細菌數量和種類(lèi)普遍減少，或某一類(lèi)細菌增多或減少，或呈單一種類(lèi)細菌；由某種病原菌引起的腹瀉，直接涂片多數只能見(jiàn)到革蘭陰性桿菌，且細菌數量少或極少，一般均與培養結果相符。結論 糞便細菌菌譜分析能直接或間接為臨床提供腹瀉患者的腸道微生態(tài)資料，尤其能準確地提示因各種原因造成菌群失調而導致的腹瀉，為臨床診斷和制定治療方案提供快捷、科學(xué)的依據。

 

 

    長(cháng)期以來(lái)，糞便標本細菌學(xué)檢驗主要是以分離沙門(mén)菌屬和志賀菌屬細菌為目的。但隨著(zhù)新的腹瀉病原菌的不斷被發(fā)現以及各種因素造成菌群失調引起的腹瀉不斷增多，傳統的糞便細菌學(xué)檢驗方法和內容已不能滿(mǎn)足現代醫學(xué)診治的要求。我們通過(guò)建立糞便涂片細菌菌譜，對糞便標本進(jìn)行病原菌分離培養，及對腸道菌菌譜的分析，為臨床提供真實(shí)可*的病因病原學(xué)診斷依據。

 

1 材料與方法

 

1.1材料

1.1.1標本來(lái)源  糞便標本568 份，均取自2003 年5-12 月來(lái)我院就診的腹瀉患者。其中門(mén)診患者54 份，住院患者484 份；男性356 份，女性212 份；< 14 歲的兒童369 人份，> 60 歲的老年人74 人份。對照糞便（性狀：軟、成形）60 份，即每做10 份標本加l 個(gè)對照。

1.1.2 培養基  5 ％羊血平皿（BA）、SS 平皿、l % 山梨醇麥康凱平皿（Mac ) ，均按標準自制。培養基干粉、藥敏紙片、診斷藥敏紙片等購自法國梅里埃生物有限公司；生化鑒定管購自杭州天和微生物生物試劑有限公司。

1.1.3 診斷血清  霍亂弧菌、腸致病性大腸埃希菌( EPEC）、沙門(mén)菌屬和志賀菌屬診斷血清，均購自衛生部蘭州生物制品研究所。

1.1.4 顯微鏡（OLYMPUS)   BX41 顯微鏡及JVCTK-C1381EG 彩色攝像儀，購自朗咖生物醫學(xué)工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 涂片染色  568 份腹瀉糞便標本和60 份正常對照糞便標本均直接涂片，革蘭染色，置油鏡下鏡檢，詳細記錄各類(lèi)細菌形態(tài)、大致數量及比例，并進(jìn)行顯微照相，標碼后存于電腦中。對照組直接涂片鏡檢，油鏡下印象：各類(lèi)細菌均有分布，數量約500-5000個(gè)/油鏡視野（嬰幼兒糞便細菌量較成人少）。革蘭陽(yáng)性（G +）桿菌、革蘭陰性（G-）桿菌、G+球菌、G-球菌等4種菌的比例約為60:35:4:1，優(yōu)勢菌為G +桿菌。

1.2.2 菌群培養  取每份糞便標本分別接種營(yíng)養平皿做4 區劃線(xiàn)（評估菌量），置36 ℃ 溫箱24,48,72h 后觀(guān)察細菌（需氧菌）在營(yíng)養平皿4 區上的生長(cháng)情況。用打加號的方法記錄細菌的生長(cháng)量，即4個(gè)劃線(xiàn)區都有菌（每一區菌落數≥10 個(gè)，下同）打4 + ; l,2,3 劃線(xiàn)區有菌打3 +; l、2 區有菌打2+; 1 區有菌打l +。同時(shí)觀(guān)察細菌在此培養基上的形態(tài)特征及各菌種間的比例，必要時(shí)挑取可疑菌落做革蘭染色，以便對菌譜分析結果作出初步判斷。對照組菌群培養：4 個(gè)劃線(xiàn)區菌量豐富可打4＋。平皿上菌落較純，為G-桿菌（未作厭氧培養）。

1.2.3 分離培養  各取一環(huán)標本分別接種BA , SS , Mac3 種培養基，36 ℃ 培養24 , 48 , 72h ，記錄細菌在各種培養基上的生長(cháng)情況，挑取可疑菌落（無(wú)色透明不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖菌落）進(jìn)行菌種鑒定。對照組分離培養：上述培養基上均未見(jiàn)到可疑菌落。

1.2.4 血清學(xué)鑒定  對疑似致病性大腸埃希菌菌落用EPEC 抗血清做凝集試驗；對疑似霍亂弧菌、沙門(mén)菌、志賀菌菌落分別用相應的抗血清做凝集試驗。

1.2.5 藥敏試驗  對檢出的致瀉菌按照美國臨床實(shí)驗室標準化委員會(huì )（NCCLS）的要求，采用K-B 法做藥敏試驗。

 

2 結果

 

2.1  糞便標本革蘭染色鏡檢  其菌群象大致分為以下幾種類(lèi)型。（l）成形、軟的正常糞便菌群象：一般是細菌量豐富，G+菌與G-菌比例恰當，細菌的形態(tài)呈現多樣性，優(yōu)勢菌為G+桿菌。（2）粘液樣膿血便菌群象：多數只見(jiàn)到G-桿菌，細菌量少或極少。（3）稀糊樣便菌群象：正常與異常菌群象并存（因為嬰幼兒糞便多以稀糊樣便為主），以G+球菌為主者，成雙、成鏈或成堆排列；有部分菌群象中可見(jiàn)到多量或少量真菌抱子及菌絲；以G-桿菌為主者細菌常呈多形性，而培養細菌種類(lèi)比較單一。（4) 水樣稀便菌群象：有相當一部分菌量稀少，或者單獨以G+球菌或G-桿菌或真菌為優(yōu)勢菌，有些標本甚至觀(guān)察不到細菌。各類(lèi)菌群象見(jiàn)彩圖1-9 （插頁(yè)）, 涂片染色鏡檢片印象見(jiàn)表l 。

2.2  菌群培養  分別于24 , 48 , 72h 觀(guān)察4 區劃線(xiàn)的營(yíng)養平皿。成形軟便標本經(jīng)過(guò)培養，4 區菌落都很豐富，可打4 +（且基本以為G-桿菌為主）。膿血便標本經(jīng)培養后，平皿上菌落數較前一種標本要少很多，多數只有1,2 區有菌,而3 ,4 區無(wú)菌或菌落極少，可見(jiàn)到1-3 種菌落，多為G-桿菌；有可疑菌落，需進(jìn)行分離鑒定。稀糊樣便經(jīng)培養后，菌落數有部分豐富，部分稀少，前者可以打4 +，后者則打1～2 + ；這種性狀的標本多數可培養出1種以上的細菌，有部分以G-桿菌為優(yōu)勢菌，有部分以G+球菌為優(yōu)勢菌，有部分可同時(shí)見(jiàn)到G+球菌和桿菌（服整腸生后，糞便中可見(jiàn)到G+桿菌）及真菌3 種或3 種以上菌落，還有部分則以真菌為優(yōu)勢菌。水樣稀便經(jīng)培養后，多數菌落稀少，可單獨以G-桿菌或G+球菌或真菌或G+桿菌為優(yōu)勢菌，也可幾種菌同時(shí)出現，另有一些標本，在上述幾種培養基上經(jīng)72h 培養后仍無(wú)細菌生長(cháng)。

2.3  分離培養  在進(jìn)行上述2 項試驗的同時(shí)，做分離培養。成形軟便經(jīng)培養，在選擇和非選擇培養基上，一般找不到致瀉菌落。膿血便培養，在選擇培養基上可見(jiàn)到2 種或2 種以上菌落，多數可找到致瀉菌。稀糊和水樣稀便經(jīng)培養，如G-桿菌為優(yōu)勢菌，則BA和選擇培養基上都可有多量或少量菌生長(cháng)，同時(shí)可找到致瀉菌菌落；如以G+菌為優(yōu)勢菌，則BA上可見(jiàn)到多量或少量G+菌菌落，真菌菌落；選擇培養基上無(wú)細菌生長(cháng)（真菌和腸球菌可在選擇培養基上生長(cháng)）。將分離出的疑似致瀉菌進(jìn)行系列生化鑒定及血清學(xué)鑒定, 568份標本分離出致瀉菌15種302株，見(jiàn)表2 。

2.4 菌譜分析  （l）成形軟便菌群象：細菌量豐富，分布均勻，兩種染色性狀細菌及各種類(lèi)型的細菌比例基本恰當，未分離出可疑菌落（致瀉菌）的標本可向臨床發(fā)出“未檢出致病菌”( BA，SS，Mac）的報告。(2）糞便為粘液膿血便，其菌群象為單一的G-桿菌，細菌量少甚至極少，培養基上能見(jiàn)到可疑病原菌菌落，經(jīng)生化系列鑒定、血清學(xué)鑒定，并做藥敏試驗，向臨床發(fā)出鑒定及藥敏報告。（3）糞便為稀糊樣或水樣，其菌群象則為G+球菌、桿菌及G-桿菌、真菌孢子、菌絲，菌量或多或少，呈純菌或無(wú)菌；培養有多量或少量G+球菌菌落、酵母樣真菌菌落，或為某種菌的純培養，或各培養基上無(wú)菌生長(cháng)（24h , 48h , 72 h 培養），對上述菌落可做鑒定，并根據菌群象、菌群培養、分離培養粗略估計某種菌的百分比，向臨床發(fā)出“XXX 菌％”、“無(wú)細菌生長(cháng)”( BA，SS，MaC，營(yíng)養平皿），提示“菌群失調”報告，不報告分離菌的藥敏結果。各科室菌譜分析統計結果見(jiàn)表3 。

2.5 糞便涂片與分離培養結果  對照302份陽(yáng)性標本糞便涂片與分離培養結果相符，67 份不相符。見(jiàn)表4 。

3 討論

 

    在人類(lèi)腸道中存在著(zhù)大量的微生物（如細菌、原蟲(chóng)、病毒等），其中主要是細菌，約占糞便固體總量的20％-30 % ，正常人糞便中的菌群分為常居菌和過(guò)路菌兩大類(lèi)，在這些菌中99％以上是厭氧菌（多數為G+桿菌），需氧菌不到1％。乳嬰糞便中多為G+菌（為嗜酸性乳桿菌、雙歧桿菌類(lèi)及糞鏈球菌）, 而成人糞便中除占優(yōu)勢的厭氧菌外多為埃希菌類(lèi)，所有這些細菌組成人類(lèi)腸道正常菌群。腸道正常菌群在一般情況下，數量及各菌種間的比例都處于一種相對的動(dòng)態(tài)平衡中。對機體的營(yíng)養、消化、吸收、防御疾病，保持人體與外界環(huán)境的平衡起著(zhù)重要的作用。一旦由于某種原因破壞了正常菌群內各種微生物之間的相互制約的關(guān)系，使菌群的量和種類(lèi)的比例發(fā)生變化時(shí)，腸道微生態(tài)環(huán)境被破壞，即出現暫時(shí)或持久的菌群失調，腸道功能發(fā)生紊亂，甚至出現明顯的臨床癥狀---腹瀉。

    對于腹瀉，臨床上習慣用病理學(xué)的觀(guān)點(diǎn)尋找病因，而忽視用生理學(xué)的觀(guān)點(diǎn)與方法去研究。本文試圖用病理學(xué)與生理學(xué)相結合的方法對腹瀉患者進(jìn)行病原微生物的檢測及腸道菌群的監測，對糞便進(jìn)行菌譜分析。一方面找出病原菌，對腹瀉進(jìn)行病原學(xué)診斷并做藥敏試驗；另一方面，通過(guò)對腸道菌群象的觀(guān)察和菌群培養，確定菌群失調，找出致瀉病因，為臨床正確應用抗生素治療，或者停用抗生素進(jìn)行菌群調整提供科學(xué)的依據。

    通過(guò)對568份糞便標本進(jìn)行菌譜分析，檢出（超量）酵母樣真菌98 株，占分離菌總數的32.45 % ，列第1位；菌譜分析為“某種腸球菌50 ％以上”或“無(wú)細菌生長(cháng)”，提示“菌群失調”標本88 份，列第2 位。檢出導致腹瀉的條件致病菌、過(guò)路菌（在涂片觀(guān)察及菌群和分離培養基上均為明顯的優(yōu)勢菌，細菌比率在30％以上）88 株（如克雷伯菌屬、銅綠假單胞菌、變形桿菌屬等）；檢出EPEC和志賀菌屬、沙門(mén)菌屬等特異性病原菌75 株。上述實(shí)驗資料可以說(shuō)明現代細菌性腹瀉病的主要病因在很大程度上是由菌群失調所致。因此，糞便細菌菌譜分析將成為對腹瀉病進(jìn)行病原學(xué)診斷和對腸道菌群進(jìn)行監測的重要手段。在表l中，有31份糞便徐片鏡檢未見(jiàn)細菌或真菌，菌群及分離培養72h 無(wú)細菌生長(cháng)。從表3可以看出，菌譜分析結果以G+球菌或酵母樣真菌為優(yōu)勢菌，或“無(wú)細菌生長(cháng)”，提示菌群失調，患者往往是住院患者、老年患者、嬰幼兒。這類(lèi)患者免疫力低下，多數長(cháng)期患病，或因外科手術(shù)，大量使用廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、激素、抗腫瘤藥等，使腸道正常菌群受到嚴重抑制，以致出現糞便標本涂片鏡檢細菌稀少、無(wú)菌或培養時(shí)無(wú)菌生長(cháng)等現象；或者引發(fā)腸球菌、真菌或其他一些耐藥菌株過(guò)度繁殖，導致腸道菌群嚴重失調而出現明顯的臨床癥狀---腹瀉。表4 顯示，糞便菌群象觀(guān)察的陽(yáng)性率比培養陽(yáng)性率高11.80 % ，這是因為直接涂片呈現的是腸道原始的微生態(tài)環(huán)境，許多微生物我們無(wú)法辯認或很難培養。

    以上實(shí)驗結果說(shuō)明，腸道菌譜分析不但能為臨床腹瀉病提供病原學(xué)診斷依據及藥敏報告，更能對腸道菌群進(jìn)行監測，也可作為抗菌藥物使用的監測窗口。本方法包括涂片、培養、藥敏試驗3 項主要內容。結果采取分級報告制：2h 報告涂片結果；24h 報告培養結果；最后（48 或72h ）對各項結果進(jìn)行綜合分析，報告鑒定和藥敏結果。平均出結果時(shí)間為36.5h ，比傳統培養及藥敏出結果的60h 大為縮短，并擴大對腹瀉的細菌學(xué)實(shí)驗診斷范圍。但由于腹瀉病因的多樣性、復雜性，腸道菌譜分析的研究有待進(jìn)一步深人與完善。

作者：盛茂地  黃金娥  卿秀平 黃宏蘭  張儉《中國感染控制雜志》