病原微生物分子分型技術(shù)研究進(jìn)展

現代分子分型技術(shù)主要包括質(zhì)粒DNA圖譜分析、限制性?xún)惹忻赶�化后的染色體DNA分析、核酸探針雜交、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、PCR和多位點(diǎn)序列分析(MLST)技術(shù)。DNA重復序列PCR技術(shù)(Rep-PCR)的實(shí)用性強、低用費、可再現性好，可用來(lái)進(jìn)行普查工作。PFGE技術(shù)分辨力高，是病原微生物分子分型的最佳選擇。而有更高分辨力和再現力的MLST新技術(shù)正在逐漸被使用。這些分子分型技術(shù)將有助于在全球范圍內進(jìn)行病原微生物流行病學(xué)研究。本文對近年來(lái)常用的病原微生物分子分型技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述。

　　1   評估分型技術(shù)標準的可行性

　　評估一項分型技術(shù)是否可行的標準有2個(gè)：完成標準(有效性)和便利標準(效率性)。完成標準包括分型能力、分辨力和分型技術(shù)間的一致性，而便利標準包括通用性、快捷性、解釋和執行的容易程度。一項分型技術(shù)的分型能力意味著(zhù)通過(guò)這項分型技術(shù)，分離株被劃分為所屬類(lèi)型的比例。再現性是指通過(guò)這種技術(shù)對同種樣品在重復檢測時(shí)，產(chǎn)生相同結果的能力。分辨力是指擁有一致的或非常相似的相關(guān)圖譜的分離株事實(shí)上具有相同的傳播途徑的可能性。2種分型技術(shù)的一致性通過(guò)使用這些技術(shù)把高度相似的分類(lèi)株分組歸類(lèi)而被評價(jià)〔1，2〕。因此，對一種分型技術(shù)來(lái)說(shuō)首選標準是有效性〔3〕。當應用于細菌病原菌時(shí)，一種分型技術(shù)必須要有效率性?xún)?yōu)點(diǎn)。通用性就是用于任何病原菌的能力，這對于醫源性病原菌感染的研究是一個(gè)非常重要的優(yōu)點(diǎn)。操作和解釋結果的容易度以及所需費用、試劑和儀器的可行性都是選擇一項分型技術(shù)的重要標準〔2-4〕。

　　2   現代分子分型技術(shù)

　　2��1   質(zhì)粒DNA圖譜分型技術(shù)   細菌質(zhì)粒分析是較早被使用的對病原微生物流行病學(xué)進(jìn)行調查的分子分型技術(shù)〔4〕。這種技術(shù)包括萃取質(zhì)粒DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。這是一種容易操作和理解的技術(shù)。由于不同菌株質(zhì)粒DNA序列和大小不同，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質(zhì)粒圖譜也將不同，因此，與流行病相關(guān)的分離株能夠被分類(lèi)分型。質(zhì)粒圖譜分析的再現性和分辨力可通過(guò)限制性?xún)惹忻赶�化質(zhì)粒而提高。支持這個(gè)方案的理論是，雖然2個(gè)不相關(guān)質(zhì)粒有相同的分子量，限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)的位置和頻率是不同的。但此技術(shù)也有應用局限，質(zhì)粒是可移動(dòng)的非染色體遺傳物質(zhì)，細菌能自發(fā)的失去或很容易的獲得，結果流行病相關(guān)的菌株可以展示不同質(zhì)粒指紋圖譜。許多質(zhì)粒帶有抗性決定因子的基因，存在于轉位子上，而轉位子很容易丟失或獲得，這同樣可以迅速改變質(zhì)粒DNA組成。產(chǎn)生圖譜的再現性也會(huì )由于質(zhì)�？臻g存在的不一致性(超螺旋的、斷口的和線(xiàn)形的)而被影響，而凝膠電泳時(shí)具有不同遷移速度。大多數病原微生物有質(zhì)粒，但沒(méi)有質(zhì)粒的就不能用此技術(shù)分型。此外，由于有些分離株中含有1個(gè)或2個(gè)質(zhì)粒，會(huì )使菌株間的分辨力降低〔4〕。

　　2��2   染色體DNA限制性?xún)惹忻阜治黾夹g(shù)   染色體DNA經(jīng)限制性核酸內切酶消化，消化后的片段再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。用限制性?xún)惹泻怂崦窧glⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA，因為它們對染色體上的酶切位點(diǎn)非常敏感，可以產(chǎn)生大量短的片段。電泳后，將獲得一系列被分離的DNA圖譜。通過(guò)比較圖譜，就可以進(jìn)行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過(guò)這種方法分型，但由于基因組DNA巨大，酶切后產(chǎn)生的片段眾多，且含有大量的重疊片段，這將導致菌株間圖譜一致性分析產(chǎn)生困難〔4〕。

　　2��3   核酸探針雜交技術(shù)   用高效率的限制性?xún)惹泻怂崦赶�化染色體DNA后，染色體就被分解成一系列不同大小的片段，具有一定的片段長(cháng)度多態(tài)性。由于片段太多(包括上述的重疊片段)，給分型帶來(lái)困難。這種分型困難可以通過(guò)印跡雜交解決。有報道，以印跡法為基礎的針對金黃色葡萄球菌進(jìn)行分型研究的2次分型法〔4〕，首先是通過(guò)金黃色葡萄球菌染色體DNA隨機擴增而制備一些探針，再使用幾株菌檢驗探針的特異性，并選擇出有效的探針。使用2次篩選到的探針與分離株進(jìn)行雜交，根據是否雜交，對分離株進(jìn)行分型，效果良好。

　　2��4   染色體DNA的脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)   PFGE分型技術(shù)是〔5〕使用對染色體有很少酶切位點(diǎn)的限制性核酸內切酶消化細菌DNA，產(chǎn)生大的DNA片段(10～800kb)，這些大片段不能通過(guò)常規電泳方法進(jìn)行有效分離。在電場(chǎng)方向周期改變(脈沖)的凝膠電泳條件下，DNA片段根據大小有效分離。PFGE產(chǎn)生的染色體DNA圖譜比用那些高頻率切割的限制性?xún)惹忻府a(chǎn)生的圖譜更為簡(jiǎn)單清晰〔6〕。理論上，所有的細菌都能使用PFGE進(jìn)行分型分類(lèi)，結果具有極高的再現性和分辨率，鑒于PFGE技術(shù)的一系列優(yōu)點(diǎn)，一些人把其視為一種理想的分型技術(shù)，并推薦作為對金黃色葡萄球菌等病原微生物分型的最優(yōu)標準技術(shù)〔4〕。使用PFGE也有一些局限，例如所需時(shí)間長(cháng)，使用的試劑非常昂貴，要求專(zhuān)門(mén)的儀器等。另外，很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離，使用不同凝膠進(jìn)行電泳得到的結果也比較復雜，這為不同實(shí)驗室間的結果比較帶來(lái)一定麻煩〔7〕

　　2��5   聚合酶鏈反應技術(shù)   聚合酶鏈反應(PCR)是一種高靈敏度的體外擴增DNA片段的技術(shù)，近年來(lái)在病原微生物分型研究上也得到了廣泛應用。而且，科學(xué)家根據微生物基因組特點(diǎn)及分型工作的需要，對PCR技術(shù)進(jìn)行了一系列的改良，使其成為了快速、簡(jiǎn)捷的分型技術(shù)。目前，常用的PCR分型技術(shù)有隨機擴增的多態(tài)性DNA技術(shù)(RAPD)和重復序列PCR技術(shù)(Rep-PCR)。RAPD是一種典型PCR衍生技術(shù)，用一系列任意的核苷酶序列(10個(gè)堿基)作為引物，通過(guò)引物與模板DNA序列隨機配對進(jìn)行PCR擴增。由于引物較短，所以退火溫度要求較低。擴增時(shí)只有距離最近、方向相反的2個(gè)引物之間的模板DNA區段才能被擴增。因此，基因組在這些區段如發(fā)生了DNA片段缺失、插入或堿基突變，就可能導致這些特定結合位點(diǎn)分布發(fā)生相應的變化。通過(guò)電泳對擴增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性進(jìn)行檢測、分析就可以反應出不同菌株基因組的DNA特點(diǎn)，從而對他們進(jìn)行分型。RAPD技術(shù)的使用范圍也非常廣，分辨結果也有較好的實(shí)驗室再現性。與其他技術(shù)相比，這種技術(shù)的優(yōu)勢是它的簡(jiǎn)便性和快捷性。分辨力依靠引物的數據和核苷酸序列而改變。使用單引物具有低分辨力，但是使用3個(gè)或3個(gè)以上引物時(shí)，會(huì )使獲得最終結果所需時(shí)間大大減少〔8，9〕。雖然RAPD的分型結果在不同實(shí)驗室間變化較大，分辨力不如PFGE技術(shù)，但在疾病暴發(fā)流行時(shí)，PAPD仍是一種分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)〔10〕。Rep-PCR技術(shù)是利用細菌基因組中廣泛分布的短重復序列為引物靶序列，進(jìn)行PCR擴增，通過(guò)對PCR產(chǎn)物電泳結果的比較，分析菌株間基因組存在的差異〔11〕。這些重復序列在原核生物界廣泛存在，這一些細菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中，光譜帶的大小和數量的不同代表著(zhù)不同菌株重復序列間的距離和重復序列的數量，該技術(shù)對于大量或少量的菌株分型均適用，簡(jiǎn)單易行。與其他分類(lèi)技術(shù)相比，這種技術(shù)有更高的分辨力。研究表明，雖然有時(shí)Rep-PCR分辨力稍低，但與PFGE獲得的結果確有很好的關(guān)聯(lián)度。最近已經(jīng)有人把Rep-PCR與其他已經(jīng)用于菌株分類(lèi)的基因分型技術(shù)相比較。分析結果顯示，Rep-PCR與RAPD和PFGE有相同的分辨力〔12〕。與RAPD相比，Rep-PCR在DNA提純中需要一額外步聚。因此，RAPD技術(shù)比Rep-PCR稍微簡(jiǎn)單快速。然而Rep-PCR技術(shù)的再現性非常好，這是RAPD無(wú)法比擬的。與PFGE相比，Rep-PCR主要的優(yōu)點(diǎn)是操作中簡(jiǎn)便和快捷。而再現性PFGE相似。

　2��6   多位點(diǎn)序列分型技術(shù)   多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(MLST)源于多位點(diǎn)酶凝膠電泳技術(shù)(MLEE)〔12〕，MLEE屬于表型分型技術(shù)，涉及到能進(jìn)行選擇性染色的蛋白電泳技術(shù)。首先，把要研究的蛋白質(zhì)從生物體中萃取出來(lái)，用電泳分離，隨后選擇性的染色。根據遷移率，每條光譜帶都反應了相應的蛋白質(zhì)基因類(lèi)型。不同位置相同蛋白質(zhì)的2條光譜帶反應出2種不同構象的不同蛋白質(zhì)，因此，是同一個(gè)基因的等位基因。MLEE有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)即特殊位點(diǎn)的堿基序列不能直接的通過(guò)分析這個(gè)位點(diǎn)的表達產(chǎn)物而推斷。因為2個(gè)不同基因序列可以表達具有相同遷移率的2種蛋白質(zhì)，它們將會(huì )在MLEE中被檢測為同1條帶。MLST技術(shù)解決了這個(gè)問(wèn)題。使用MLST技術(shù)，不分析基因的表達產(chǎn)物，而是分析基因的核苷酸序列。1個(gè)基因突變后，形成不同的核苷酸序列，將明確被認定為是這個(gè)基因的等位基因。使用MLST技術(shù)時(shí)，對于每個(gè)菌株都要選擇一定的核甘酸位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通常位于持家基因內部片段之內，片段長(cháng)度約500bp序列。選擇持家基因是由于在待測菌株中，它們通�？隙ù嬖�，并有足夠的變異度來(lái)適合在這些位點(diǎn)產(chǎn)生變異的等位基因的存在。已經(jīng)有人使用PFGE方法證實(shí)了MLST技術(shù)對金黃色葡萄球菌分型的有效性。他們發(fā)現用MLST技術(shù)分為1組的各個(gè)菌株具有相似的PFGE圖譜，相反用MLST技術(shù)得到的不同菌株具有顯著(zhù)不同的PFGE圖譜〔5〕。MLST的絕對分辨能力可超過(guò)20×109個(gè)等位基因圖譜。通過(guò)等位基因圖譜定義的菌株類(lèi)型由不多于7個(gè)的1串數字組成，這種信息是清晰的并且很容易在全球通過(guò)電子媒介傳達。而且，那些難以計數的圖株類(lèi)型的等位基因圖譜可以通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)很容易的被商議和統一，從而使全球的流行病學(xué)數據標準化〔13〕。MLST的缺點(diǎn)是它的高額費用和操作過(guò)程所需的特定儀器。這使得這項技術(shù)只能局限在大型的全球性流行病學(xué)研究中心使用，影響其在醫院推廣普及。

　　3   小結

雖然標準的解釋Rep-PCR圖譜的要點(diǎn)還沒(méi)有最終確定，但是它具有的高分辨力、簡(jiǎn)單易行和良好的可再現性等特點(diǎn)，還是決定了它在目前以及今后一定時(shí)間內是最佳的病原微生物分子分型技術(shù)，尤其在缺乏專(zhuān)業(yè)儀器設備的實(shí)驗室(如不能進(jìn)行PFGE技術(shù)和DNA測序工作的實(shí)驗室)，以及疾病暴發(fā)流行的譜查階段，它將是首選的技術(shù)。PFGE技術(shù)雖然耗時(shí)長(cháng)、技術(shù)復雜，但確是一種能獲得最佳分型結果的技術(shù)，有效地強化它的再現性。由于它所使用的儀器相對便宜，PFGE的使用將會(huì )普及，并被用來(lái)解決其他簡(jiǎn)單分型遺留的不足。長(cháng)期以來(lái)，找到一種有足夠分辨力的技術(shù)區分與流行病相關(guān)的菌株是一項技術(shù)難題。解決這個(gè)難題的方法是在一項研究中使用一種以上技術(shù)，一種技術(shù)的缺點(diǎn)會(huì )被其他技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)所代替。分子分型技術(shù)對于病原微生物分型是非常有價(jià)值的手段，將得到更加廣泛的推廣使用。

作者：李雪 金莉莉 王秋雨《中國公共衛生》

  　　〔1〕 Power EGM.RAPD-typing in microbiology:a technical review［J］.J Hosp Infect,1996,34:247-265.

　　〔2〕 Struelens MJ.European study group on epidemiological markers.Consensus guidelines for appropiate use and evaluation of microbial epidemiologic systems［J］.Clin Microbiol Infect,1996,2:2-11.

　　〔3〕 Struelens M J.Molecular epidemiologic typing systems of bacterial pathogens:current issues and perspectives［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz,1998,93:581-585.

　　〔4〕 Trindade PA,McCulloch J A,Oliveira GA,et al.Molecular techniques for MRSA typing:current issues and perspectives［J］.The Brazilian Journal of Infectious Diseases,2003,7(1):32-43.

　　〔5〕 Guerra B,Helmuth R,Tsen HY,et al.Pulsed-field gel electrophoresis,plasmid profiles and phage types for the human isolates of Salmonella enterica serovar enteritidis obtatined over 13 years in Taiwan［J］.J Appl Microbiol,2005,99(6):1472-1483.

　　〔6〕 Tayfour MA,Eris FN,Alanazi AR.Comparison of antibiotic susceptibility tests,plasmid profiles and restriction enzyme analysis of plasmid DNA of methicllin susceptible and resistant-Staphylococcus aureus strains isolated from intensive care units［J］.Saudi Med J,2005,26(1):57-63.

　　〔7〕 Lukacsi G,Tako M,Nyilasi I.Pulsed-field gel electrophoresis:a versatile tool for analysis of fungal genomes［J］.Acta Microbiol Immunol Hung,2006,53(1):95-104.

　　〔8〕 Baldy-Chudzik K.Rep-PCR-a variant to RAPD or an independent technique of bacteria genotyping? A comparison of the typing propertise of rep-PCR with other recognised methods of genotyping of microorganisms［J］.Acta Microbiol Pol,2001,50(3-4):189-204.

　　〔9〕 Ugorski M,Chmielewski P.REP and ERIC repetitive DNA sequences in bacteria-diagnostic significance［J］.Postepy Hig Med Dosw,2000,54(1):3-15.

　　〔10〕 Chiou C,Wei H,Yang L.Comparison of pulsed-field gel electrophoresis and coagulase gene restriction profile analysis techniques in the molecular typing of Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol,2000,38:2186-2190.

　　〔11〕 Kumari DN P,Keer V,Hawkey PM,et al.Comparison and application of ribosome spacer DNA amplicon polymorphisms and pulsed-field gel electrophoresis for differentiation of methicillin-resistans Staphylococcus auresu strains［J］.J Clin Microbiol,1997,35:881-885.

　　〔12〕 劉佳妍，金莉莉，王秋雨.細菌基因組重復序列PCR技術(shù)及其應用［J］.微生物學(xué)雜志，2006，26(3)：90-93.

〔13〕 Vazquez JA,Berron S.Multilocus sequence typing:the molecular marker of the Internet era［J］.Enferm Infecc Microbiol Clin,2004,22(2):113-120.