快速檢測食品中微生物方法的進(jìn)展

【摘要】  快速檢測食品中微生物的方法在食品衛生檢驗方面起著(zhù)越來(lái)越重要的作用，最終將達到預防腸道傳染病和食物中毒的發(fā)生的目的�？焖俜椒ò�括即用型紙片法、生物化學(xué)技術(shù)、選擇鑒定用培養基法、免疫學(xué)技術(shù)、細菌直接計數法、全自動(dòng)微生物分析系統等。本文對上述各種快速檢測食品中微生物的方法的研究進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】  快速檢測；食品；微生物

　　Progress of the Quick Inspection Methods of Microorganisms in the Food

　　Abstract: These quick inspection methods play a more and more important role in the food hygiene．and will achieve the purpose of prevent the contagions of alimentary canal and bacterial food poisoning in finally. The quick inspection methods of microorganisms in the food include quick inspection paper, molecular biology detection method，choose appraisal medium method, immunology method, bacterium direct counting method，automatic microbial monitoring system etc． This article has summarized the quick inspection methods of microorganisms in the food.

　　Key words: Quick�瞚nspection；Food；Microorganism

　　隨著(zhù)人們生活水平不斷提高，食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視，微生物對食品的污染問(wèn)題也相應地備受關(guān)注。在食品生產(chǎn)、加工、儲存、運輸、銷(xiāo)售等各個(gè)環(huán)節中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物將大量繁殖而引起食品腐敗變質(zhì)，或導致食源性感染和食物中毒。特別是近年來(lái)隨著(zhù)環(huán)境污染的加劇和生態(tài)平衡的不斷破壞，可導致人類(lèi)感染的致病菌的種類(lèi)越來(lái)越多，病原微生物對人類(lèi)的威脅越來(lái)越大。傳統的檢驗方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，其準確性、靈敏性均較高，但涉及的實(shí)驗較多、操作煩瑣、需要時(shí)間較長(cháng)、準備和收尾工作繁重，而且要有大量人員參與［1，2］。所以，準確、省時(shí)、省力和省成本的快速檢驗方法是社會(huì )的迫切需要。本文對食品中微生物的快速檢測方法進(jìn)展情況進(jìn)行綜述，以利于對食品進(jìn)行篩選和檢測，最終達到預防腸道傳染病和食物中毒的發(fā)生的目的。

　　1  即用型紙片法

　　3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物測試片，可分別檢測菌落總數、大腸菌群計數、霉菌和酵母計數［3］。由RCP Scientific Inc 公司開(kāi)發(fā)上市的Regdigel系列，除上述項目外還有檢測乳桿菌、沙門(mén)菌、葡萄球菌的產(chǎn)品［3］，這兩個(gè)系列的產(chǎn)品與傳統檢測方法之間的相關(guān)性非常好。如用大腸菌群快檢紙片檢測餐具的表面，操作簡(jiǎn)便、快速、省料，特異性和敏感性與發(fā)酵法符合率高，已經(jīng)被列為國標方法。使用時(shí)應正確掌握操作技術(shù)和判斷標準，從而達到理想的檢測效果［4］。美國3M公司生產(chǎn)的PF(Petrifilm)試紙還加入了染色劑、顯色劑，增強了菌落的目視效果，而且避免了熱瓊脂法不適宜受損細菌恢復的缺陷。在大腸菌群檢測方面，國標方法報告的是MPN值而不是每克食品中的大腸菌群數，PF法則可以得出精確數據［1］。霉菌快速檢驗紙片，應用于食品檢驗中的霉菌具有操作簡(jiǎn)便，僅需36℃培養，不需要低溫設備；快速，僅需2 d就可觀(guān)察結果，比現在的國家標準檢驗方法縮短3 d～5 d，大大提高了工作效率。紙片法與國標法在霉菌檢出率上差異無(wú)顯著(zhù)性，且菌落典型，易判定。紙片熒光法利用細菌產(chǎn)生某些代謝酶或代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)而建立的一種酶��底物反應法。只需檢測食品中大腸菌群、大腸桿菌的有關(guān)酶的活性，將熒光產(chǎn)物在365 nm紫外光下觀(guān)察即可。同時(shí)紙片可高壓滅菌處理，4℃保存，簡(jiǎn)化了實(shí)驗準備、操作和判斷［6］。

　　2  生物化學(xué)技術(shù)

　　2.1  PCR技術(shù)  PCR技術(shù)采用體外酶促反應合成特異性DNA片段，再通過(guò)擴增產(chǎn)物來(lái)識別細菌。由于PCR靈敏度高，理論上可以檢出一個(gè)細菌的拷貝基因，因此在細菌的檢測中只需短時(shí)間增菌甚至不增菌，即可通過(guò)PCR進(jìn)行篩選，節約了大量時(shí)間，但PCR技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)：食物成分、增菌培養基成分和其他微生物DNA對Taq酶具有抑制作用，可能導致檢驗結果假陰性；操作過(guò)程要求嚴格，微量的外源性DNA進(jìn)入PCR后可以引起無(wú)限放大產(chǎn)生假陽(yáng)性結果；擴增過(guò)程中有一定的裝配誤差，會(huì )對結果產(chǎn)生影響。最近，美國快力康公司推出了全球第一臺PCR全自動(dòng)檢測儀�睟AX系統，克服手工操作PCR的缺點(diǎn)，能用于檢測細菌，敏感性和特異性都非常好［7］。

　　2.2  基因探針技術(shù)  基因探針技術(shù)利用具有同源性序列的核酸單鏈在適當條件下互補形成穩定的DNA�睷NA或DNA�睤NA鏈的原理，采用高度特異性基因片段制備基因探針來(lái)識別細菌�；�因探針的優(yōu)點(diǎn)是減少了基因片段長(cháng)度多態(tài)性所需要分析的條帶數。如法國生物一梅里埃公司的GEN�睵ROBE基因探針檢測系統，對于分離到的單個(gè)菌落，30 min完成微生物的確證試驗［7］，基因探針的缺點(diǎn)是不能鑒定目標菌以外的其他菌。

　　3  選擇、鑒定用培養基法

　　在培養基中加入特異性的生化反應底物、抗體、熒光反應底物、酶反應底物等，可使目標培養物的選擇、分離、鑒定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血漿+纖維蛋白原)培養基，可在24 h內鑒定金黃色葡萄球菌［8］。Merk公司的chro�瞞ocult Coliform Agar培養基上，大腸桿菌為墨綠色至紫色菌落，沙門(mén)菌為淡綠色至藍綠色菌落。檸檬酸桿菌和克雷伯桿菌為橙紅色至紅色菌落，其他腸道菌為無(wú)色菌落［9］。

　　4  免疫學(xué)技術(shù)

　　免疫學(xué)技術(shù)通過(guò)抗原和抗體的特異性結合反應，再輔以免疫放大技術(shù)來(lái)鑒別細菌。免疫方法的優(yōu)點(diǎn)是樣品在進(jìn)行選擇性增菌后，不需分離，即可采用免疫技術(shù)進(jìn)行篩選。由于免疫法有較高靈敏度，樣品經(jīng)增菌后可在較短的時(shí)間內達到檢出度，抗原和抗體的結合反應可在很短時(shí)間內完成［10］。如采用免疫磁珠法可有效地收集、濃縮神奈川現象陽(yáng)性的副溶血性弧菌，可顯著(zhù)提高環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率［11］。膠體金免疫層析法能快速、靈敏檢測金黃色葡萄球菌［12］，應用膠體金免疫層析法檢測食品中的沙門(mén)菌，簡(jiǎn)便快速，無(wú)需特殊儀器設備，適合現場(chǎng)檢測之用［13］。ATP生物發(fā)光法是近年發(fā)展較快的一種用于食品生產(chǎn)加工設備潔凈度檢測的快速檢測方法。利用ATP生物發(fā)光分析技術(shù)和體細胞清除技術(shù)，測量細菌ATP和體細胞ATP， 細菌ATP的量與細菌數成正比，用ATP生物發(fā)光分析技術(shù)檢測肉類(lèi)食品細菌污染狀況或食品器具的現場(chǎng)衛生學(xué)檢測，都能夠達到快速適時(shí)的目標［14，15］。微型自動(dòng)熒光酶標分析法(mini VIDAS)是利用酶聯(lián)熒光免疫分析技術(shù)，通過(guò)抗原��抗體特異反應，分離出目標菌，由特殊儀器根據熒光的強弱自動(dòng)判斷樣品的陽(yáng)性或陰性。VIDAS法檢測凍肉中沙門(mén)菌具有很高的靈敏度和特異性，用于進(jìn)出口凍肉的檢測，可大大縮短檢驗時(shí)間，加快通關(guān)速度［16］，檢測凍肉中李斯特氏菌亦如此［17］。

　　5  細菌直接計數法

　　主要包括流式細胞儀(flow cytometry，FCM)和固相細胞計數(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作為發(fā)光源，經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。光散射信號基本上反映了細胞體積的大��；熒光信號的強度則代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質(zhì)的濃度，由此可通過(guò)儀器檢測散射光信號和熒光信號來(lái)估計微生物的大小、形狀和數量。流式細胞計數具有高度的敏感性，可同時(shí)對目的菌進(jìn)行定性和定量［18］。目前已經(jīng)建立了細菌總數［19］、致病性沙門(mén)菌、大腸埃希氏菌［20］等的FCM檢驗方法。固相細胞計數可以在單個(gè)細胞水平對細菌進(jìn)行快速檢測［21］。濾過(guò)樣品后，存留的微生物在濾膜上進(jìn)行熒光標記，采用激光掃描設備自動(dòng)計數。每個(gè)熒光點(diǎn)可直觀(guān)地由通過(guò)計算機驅動(dòng)的流動(dòng)臺連接到ChemScan上的落射熒光顯微鏡來(lái)檢測，尤其對于生長(cháng)緩慢的微生物，檢測用時(shí)短使該方法明顯優(yōu)于傳統平板計數法［22］。

　6  全自動(dòng)微生物分析系統(AMS)

AMS是一種由傳統生化反應及微生物檢測技術(shù)與現代計算機技術(shù)相結合，運用概率最大近似值模型法進(jìn)行自動(dòng)微生物檢測的技術(shù)，可鑒定由環(huán)境、原料及產(chǎn)品中分離的微生物。AMS僅需4 h～18 h即可報告結果，以常規法鑒定細菌，只能得到是或不是某種菌，要想知到是哪種菌還要做大量、煩瑣的生化試驗，而AMS則可以直接報告是什么菌［23］。法國生物梅里埃集團公司出品的Vitek�睞MS自動(dòng)微生物檢測系統屬當今世界上最為先進(jìn)、自動(dòng)化程度最高的細菌鑒定儀器之一。Vitek對細菌的鑒定是以每種細菌的微量生化反應為基礎，不同種類(lèi)的Vitek試卡(檢測卡)含有多種的生化反應孔，可達30種，可鑒定405種細菌［24］。用AMS明顯縮短腸道菌生化鑒定的時(shí)間，如鑒定沙門(mén)菌屬只需4 h，鑒定志賀氏菌屬只需6 h，鑒定霍亂弧菌等致病性弧菌亦只需4 h～13 h［22］�？傊�，隨著(zhù)現代科技的發(fā)展，可以預料在不遠的將來(lái)，傳統的微生物檢測技術(shù)將逐漸被各種新型簡(jiǎn)便的微生物快速診斷技術(shù)所取代。近年來(lái)興起的基因探針技術(shù)及全自動(dòng)微生物檢測系統，將從根本上改變微生物的檢測方法，具有非常廣闊的應用前景。

作者：趙冬云《實(shí)用醫技雜志》

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