應用微生物改良法測定紅細胞葉酸的研究

  摘 要  目的:研究微生物改良法測定紅細胞葉酸（RCF）的可靠性。方法:用本方法檢測不同疾病患者100例和健康自愿者50例的紅細胞葉酸含量。對高、低兩個(gè)質(zhì)控標準的精密度、穩定性及實(shí)驗相關(guān)性等指標進(jìn)行評價(jià)。結果:本方法化學(xué)性能的評價(jià)表明:批內變異系數為2.228%和3.620%，批間變異系數為5.12%和7.51%。各廠(chǎng)家的試劑相關(guān)性良好（r=0.9544，n=50）。50名健康自愿者測定結果表明RCF的正常參考值為586.3±69.6ng/mL。結論:本方法測定結果準確、可靠且操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗條件簡(jiǎn)單，適宜于推廣。

    關(guān)鍵詞  紅細胞葉酸;微生物改良法;巨幼細胞貧血

    血液中的葉酸水平異常偏低，除與葉酸缺乏的巨幼細胞貧血有關(guān)外，還與胎兒神經(jīng)管缺陷有關(guān)，引起同型半胱氨酸血癥，可影響血管功能和增加卒中危險。因而血液中的葉酸水平的檢測受到高度重視。測定葉酸的方法基本上是微生物改良法和競爭結合兩類(lèi)，我們用微生物改良法對紅細胞葉酸（RCF）進(jìn)行了初步的研究。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1  菌株制備:購買(mǎi)耐氯霉素乳酸菌（NCIMB10463）凍干菌株。將凍干的菌株懸浮于5mL保養液37℃孵育18h后;混勻取1滴加入新的5mL保養液，37℃孵育18h（該菌株可以在-4℃保存2W，用于菌株的繁殖）后;混勻取0.5mL加入5mL保養液，37℃孵育6h后;用生理鹽水清洗5次，最后用5mL生理鹽水懸�。ê�(jiǎn)稱(chēng)清洗后6h菌株）。

    1.1.2  測量液:按培養基2.35g，氯霉素0.02g，V-C0.1g，Tween-80（1∶10稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US>0.1mL，去離子水100mL的比例配制，以5mL為單位分裝。

    1.1.3  保養液:每升測量液中加標準葉酸10mL，按5mL/支分裝于無(wú)菌帶塞試管，置-20℃可保存1年。標準葉酸濃度:10ng/mL。

　　 1.3 測定樣本

    ①定值高值質(zhì)控標準=2.252ng/mL，低值質(zhì)控標準=1.761ng/mL;分裝后于-70℃保存，保證質(zhì)控標準只凍融1次。②病人標本，不同疾病患者100例及健康自愿者50例，年齡25歲～40歲。所有標本均空腹，采肘靜脈血2mL～3mL，置EDTA干燥管內，按1∶10比例稀釋在1%的V-C液中（稱(chēng)V-C血）于-20℃貯存。

    2 微生物測定法

    2.1.  按表1和表2操作配制孵育試管。表1 標準曲線(xiàn)管孵育前配制表2 紅細胞葉酸標本孵育前配制

    2.2.  上述試管在37℃孵育18h后，搖勻，用721-分光光度計（在波長(cháng)λ=660mm處）比濁。以葉酸濃度為橫軸，以光密度值（OD值）為縱軸做出標準曲線(xiàn)。試管1和試管2的OD值首先扣除同濃度空白對照管的OD值，然后由標準曲線(xiàn)查出該試管的葉酸值，標本的V-C血RCF（ng/mL）=（試管1葉酸值×0.04+試管2葉酸值×0.02）/2。標本的紅細胞葉酸值（RCF）按以下公式進(jìn)行計算:RCF（ng/mL）=［（V-C血RCF×10）/紅細胞壓積］ng/mL。

    3 結果

    3.1 精密度實(shí)驗

    取高、低值質(zhì)控血清，平行測定20次，計算批內CV，低值血清CV=2.228%，高值血清CV=3.620%。連續測20d，計算批間CV，低值血清CV=5.12%，高值血清CV=7.51%。

　　 3.2 穩定性實(shí)驗

    按照菌株制備方法將凍干的菌株打開(kāi)后，測定并繪制標準曲線(xiàn)圖，測定高值、低值質(zhì)控的RCF值;同時(shí)用保養液使菌株長(cháng)期保存。并分別在第3d、7d、14d、20d、30d、50d、75d、100d使用保養液的菌株繪制標準曲線(xiàn)圖，測定高值、低值質(zhì)控的RCF值。高值質(zhì)控的CV=5.18%、低值質(zhì)控的CV=3.03%。

3.3 相關(guān)實(shí)驗

    取50份標本同時(shí)用本法與美國DPC公司提供的進(jìn)口的葉酸（固相非煮沸雙相計數）放免試劑盒對RCF進(jìn)行測定，相關(guān)系數r=0.9544。 3.4 正常參考值

    選取50名年齡在25歲～40歲健康人標本用本方法進(jìn)行紅細胞葉酸測定，用平均值±兩個(gè)標準差的方法進(jìn)行統計計算正常參考值，測定結果表明RCF的正常參考值為（586.3±69.6）ng/mL。

    4 討論

    葉酸在體內代謝極為重要的單碳轉運中起著(zhù)關(guān)鍵性作用。血液中的葉酸缺乏除與巨幼細胞貧血有關(guān)外，還與胎兒神經(jīng)管缺陷有關(guān)，引起同型半胱氨酸血癥［1］ ，可影響血管功能和增加卒中危險 ［2，3］ 。由于紅細胞內所含葉酸濃度比血清所含

    葉酸濃度高10倍～20倍，因而紅細胞葉酸比血清葉酸更能代表組織內葉酸水平，當組織內葉酸水平已經(jīng)缺乏，但尚未出現巨幼細胞貧血時(shí)，紅細胞葉酸的測定對葉酸缺乏作出的決定更有價(jià)值 ［4］ ;而且血清葉酸的結果易受多種因素的影響，如:炎癥、肝病、腫瘤等 ［5］ 。因此雖然血清葉酸降低代表早期葉酸缺乏，但紅細胞葉酸減低，不受外來(lái)因素的影響，確實(shí)反映了組織葉酸水平的減低。

測定葉酸的方法基本上是微生物改良法和競爭結合法兩類(lèi)，后者操作簡(jiǎn)單、靈敏、但是價(jià)格昂貴，目前國內多數用于測定血清葉酸（SF）。當肝腎功能受損時(shí)，葉酸可以聚合。這種聚合體用競爭結合法不能測定（除非這種聚合被解開(kāi)）;但微生物改良法可以測定血液中總葉酸值（包括上述聚合體），因此用微生物改良法能滿(mǎn)足臨床測定肝、腎受損病人的總葉酸值。微生物改良法是經(jīng)典的方法，材料來(lái)源廣泛，并且用保養液可以使菌株長(cháng)期保存。如果保存不當，致使菌株受雜菌污染或死亡，可以重新購買(mǎi)凍干菌株，十分簡(jiǎn)單便利地重新建立該實(shí)驗;不需要購買(mǎi)特殊儀器;對儀器和實(shí)驗條件要求較低;適用于大批標本測定。本實(shí)驗觀(guān)察了長(cháng)期保存的菌株，其實(shí)驗穩定性良好;與美國DPC公司提供的進(jìn)口的葉酸（固相非煮沸雙相計數）放免試劑相關(guān)性顯著(zhù)。因此便于在臨床上推廣使用。

作者：李建蘭 楊波 冉家彥《長(cháng)治醫學(xué)院學(xué)報》

    參考文獻

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［5］ 楊慧敏，陳覺(jué)凝，余靈，等.82名正常兒童紅細胞葉酸、堿性鐵蛋白水平測定及臨床意義.中國小兒血液，1998，3:260.

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