彎曲菌菌種冷凍保存及復蘇方法的研究

摘　要:目的　探索一種簡(jiǎn)單、方便、有效的彎曲菌菌種保存方法。方法　采用含30%甘油的腦心浸液肉湯,將實(shí)驗室保存的19 株彎曲菌于-30℃和-70℃分別保存,每個(gè)菌株3 個(gè)菌種管。1 年后,采用5%脫纖維羊血的布氏肉湯進(jìn)行增菌,然后轉種哥倫比亞血平板,比較存活效果。結果　-30℃條件下采用多管法保存彎曲菌可以獲得與-70℃條件下保存相當的效果。結論　采用多管法(每株菌3 個(gè)菌種管) 于-30℃冷凍保存彎曲菌是一個(gè)簡(jiǎn)單、方便、有效、實(shí)用的方法。 

關(guān)鍵詞:彎曲桿菌屬;保存,生物學(xué);低溫保存 
　　

      彎曲菌是一類(lèi)對生長(cháng)條件要求非�？量痰募毦�,需要在微需氧的環(huán)境下才能良好地生長(cháng)。彎曲菌也是一類(lèi)保存比較困難的細菌,用一般的方法保存有一定的困難,在實(shí)際菌種保藏工作中如操作不當極易造成菌種的死亡。有效的保存分離菌株是對彎曲菌進(jìn)行研究的基礎。在過(guò)去的研究中,采用的保存方法種類(lèi)比較多,文獻[1 ,2]采用真空冷凍干燥技術(shù)進(jìn)行保存菌種,在FDA 的方法[3] 中,介紹冷凍培養基-70℃冷凍保存以及半固體保存方法,在國標[4] 中短期采用4℃冰箱微需氧保存,長(cháng)期保存用凍干法。在上述方法中最穩定有效的方法是真空冷凍干燥技術(shù),但是該方法較為復雜,還需要冷凍干燥設備。而半固體和新鮮菌落于微需氧條件下保存的時(shí)間比較短。-70℃冷凍保存方法相對簡(jiǎn)單,但是-70℃冰箱價(jià)格昂貴,基層單位比較少。在對菌種的復蘇方法中,有的直接將菌種涂布平板微需氧培養[1] ,有的將菌種加入增菌液中進(jìn)行增菌后再涂布血平板[3] ,復蘇方法的差異會(huì )嚴重影響菌種保存的效果。為探索一套方便有效的彎曲菌菌種保存及復蘇方法,本實(shí)驗室用30 %的甘油腦心浸液肉湯,分別在-30℃及-70℃對彎曲菌菌種進(jìn)行多管(每個(gè)菌種3個(gè)管) 冷凍保藏,復蘇時(shí)用不加抗生素的布氏肉湯,于微需氧條件復蘇培養24 h ,轉種哥倫比亞血平板微需氧條件培養48 h。

1 　材料及方法 
1.1 　培養基　哥倫比亞血瓊脂　哥倫比亞基礎培養基(OXOID) ,按照培養基配置的說(shuō)明進(jìn)行配置并進(jìn)行高壓滅菌,將培養基保溫到45 ℃,然后加入5 %的脫纖維羊血制血平板。腦心浸液肉湯　腦心浸液干粉培養基(北京陸橋技術(shù)有限責任公司) 按照培養基的配置說(shuō)明操作,高壓滅菌。布氏肉湯2 號營(yíng)養肉湯(OXOID ,Basing Stoke ,Hampshire ,England) 按照培養基說(shuō)明進(jìn)行配制,高壓滅菌,加入5%脫纖維羊血。 
1.2 　菌株　2004 年及2005 年北京市疾病預防控制中心營(yíng)養與食品衛生所微生物實(shí)驗室從市場(chǎng)銷(xiāo)售的禽肉中分離到的彎曲菌屬菌株19 株,其中包括空腸彎曲菌、結腸彎曲菌和紅嘴鷗彎曲菌。 
1.3 　低溫冰箱　-30℃低溫冰箱(SANYO ,MedicalFreezer) 、-70℃冰箱(SANYO ultra2low freezer) ,塑料菌種管(118 ml 冷凍管、彩蓋硅膠墊圈) (上海嘉迪塑料制品有限公司) 。 
1.4 　方法 
1.4.1 　菌種制備　將彎曲菌菌種劃線(xiàn)接種于哥倫比亞血瓊脂平板, 42 ℃微需氧條件下培養48 h ,獲得活力旺盛的菌體。菌種保存　按照體積比將腦心浸液肉湯加入30 %的滅菌甘油,分裝到塑料菌種保存管中備用,也可以將其冷凍保存隨用隨取。用接種環(huán)刮取哥倫比亞平皿表面的菌體,溶于腦心浸液肉湯甘油中。將菌濃度調到6 個(gè)麥氏濃度以上。將制好的腦心浸液甘油菌懸液,于-30℃或-70℃的冰箱中迅速冷凍。
1.4.2 　菌種的復蘇　將菌種管從冰箱中取出,室溫放置呈為液態(tài)后,將整管的菌懸液加入到未加抗生素的布氏肉湯10 ml 中,在微需氧的條件下培養24h ,如菌體損傷嚴重,需要復蘇的時(shí)間較長(cháng),培養24 h菌體得不到有效的復蘇,需要再繼續培養24 h。將培養24～48 h 的增菌液劃線(xiàn)接種于哥倫比亞血平板,于微需氧的條件下培養48 h 得到復蘇的菌種。將本實(shí)驗室從禽類(lèi)中分離到的彎曲菌19 株按上述方法于2005 年4 月保存,并于2006 年4 月取出,用上述方法進(jìn)行復蘇,檢驗菌種保存的效果。 
2 　結果 
2.1 　在-70℃保存的菌種共19 株,采用本方法全部存活。 
2.2 　在-30℃保存的菌種共19 株,在菌種復蘇培養過(guò)程中3 個(gè)菌種管中的彎曲菌在增菌過(guò)程中沒(méi)有復蘇成功,但由于在保存的過(guò)程中,1 個(gè)菌株保存了3 管,其它菌種管保存的菌株用相同方法進(jìn)行培養獲得了成功。本文采用加入30 %甘油的腦心浸出液肉湯對彎曲菌進(jìn)行菌種保存,用未加抗生素的布氏肉湯進(jìn)行復蘇,此方法簡(jiǎn)單、實(shí)用、有效,不需要特殊的設備,適用于基層微生物實(shí)驗室日常彎曲菌菌株保存工作。 

作者：駱海朋 陳倩《中國食品衛生雜志》

參考文獻 
[1] 　張建中,蔣秀麗,陳晶晶,等. 幽門(mén)螺桿菌的冷凍干燥保存法[J ] . 華人消化雜志,1998 ,6(12) :107521076. 
[2] 　OWEN RJ , ON SL , COSTASM. The effect of cooling rate ,freeze -drying suspending fluid and culture age on the preservation ofCampylobacter 

pylori [J ] . J Applied Bacteriol ,1989 ,66 : 3312337. 
[3] 　U S Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manualOnline 

march 2001 Chapter 7 Campylobacter[ Z] . 
[4] 　GBPT 478919 —2003. 食品衛生微生物學(xué)檢驗空腸彎曲菌檢驗[S]. 
[5] 　鄭曉東, 主編. 食品微生物學(xué)[M] . 杭州: 浙江大學(xué)出版社,2001 : 1172118. 
[6] Food2borne pathogens monograph number 3 : Campylobacter. Technicalsupport 

department ,oxoid ,unip

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