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【摘要】 目的：通過(guò)觀(guān)察空腸彎曲菌抗體在正常結腸神經(jīng)節細胞上的結合，初步探討空腸彎曲菌抗體影響結腸神經(jīng)節細胞發(fā)育，導致神經(jīng)節細胞變性的可能性。方法：取正常結腸標本60例，隨機分為實(shí)驗組和對照組，免疫組織化學(xué)方法處理。實(shí)驗組利用空腸彎曲菌抗體作用于正常結腸神經(jīng)節細胞，觀(guān)察抗體與神經(jīng)節細胞的結合情況；對照組利用PBS液代替空腸彎曲菌抗體，其他同實(shí)驗組。比較兩組空腸彎曲菌抗體的結合有無(wú)不同。結果：空腸彎曲菌抗體可以和正常結腸的神經(jīng)節細胞結合，結合的陽(yáng)性率為83.3%。實(shí)驗組和對照組比較差異有統計學(xué)意義（P＜0.05）。結論：空腸彎曲菌抗體可與神經(jīng)節細胞結合，可能影響神經(jīng)節細胞發(fā)育及導致神經(jīng)節細胞變性。
【關(guān)鍵詞】 彎曲菌•神經(jīng)節•腸神經(jīng)元發(fā)育異常
腸神經(jīng)元發(fā)育異常（neuronal intestinal malformations，NIM）是小兒外科常見(jiàn)的消化道神經(jīng)發(fā)育畸形，包括先天性巨結腸（Hirschsprung’s disease，HD）和巨結腸類(lèi)緣�。╝llied disorders of Hirschsprung’s disease，ADHD），其基本的病理病因是神經(jīng)元發(fā)育異常導致正常神經(jīng)節細胞減少或者缺如。而某種或某些細菌、病毒可能是影響腸神經(jīng)節細胞發(fā)育、甚至變性壞死因素［１］。研究表明空腸彎曲菌感染可以導致外周神經(jīng)系統的損傷如格林-巴利綜合征［２-３］。由于空腸彎曲菌容易傳染，因而被認為是全世界導致細菌性腹瀉的主要原因之一�？漳c彎曲菌感染后廣泛存在于腸道，能損傷結直腸，存在導致腸神經(jīng)節細胞損傷的可能。本研究通過(guò)檢測空腸彎曲菌抗體在正常結腸神經(jīng)節細胞的結合情況，初步探討空腸彎曲菌影響神經(jīng)節細胞發(fā)育、甚至變性壞死的可能性。
1 資料與方法
1.1 一般資料 收集2005年7月—2006年7月于山東大學(xué)第二醫院小兒外科行結腸造瘺、腸梗阻、腸代膀胱手術(shù)切除結腸的60例患兒臨床資料，其中男36例,女24例。年齡4個(gè)月~4.5歲,平均年齡（2.33±1.93）歲,所有患兒結腸標本術(shù)后病理組織學(xué)證實(shí)神經(jīng)節細胞正常。所有標本隨機分為實(shí)驗組、對照組，每組30例。
1.2 免疫組織化學(xué)方法 組織標本10%甲醛固定，常規石蠟包埋后進(jìn)行鏈酶親和素-辣根過(guò)氧酶免疫組織化學(xué)染色，4 μm切片脫蠟至水，實(shí)驗組加入兔抗人空腸彎曲菌IgG（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）作為一抗，生物素化山羊抗兔IgG（生產(chǎn)廠(chǎng)家）作為二抗。對照組用PBS液代替一抗，其他同實(shí)驗組。
1.3 結果判定 參考文獻［4］的方法并稍做修改。神經(jīng)節細胞內出現棕黃色顆粒為免疫組織化學(xué)陽(yáng)性細胞，以染色的深淺及陽(yáng)性細胞數作為觀(guān)察指標，與背景完全一致的記為1，淡黃色記為2，中等黃色記為3，棕黃色記為4。每張切片在10個(gè)高倍鏡視野下,分別計數50個(gè)細胞，計算陽(yáng)性細胞的百分比，＜10%記為1， 10%～30%記為2， 30%～50%記為3，>50%記為4。以陽(yáng)性細胞和染色強度之和的平均數作為定量標準：＜3為陰性表達（-），≥3為陽(yáng)性表達（+），所有切片結果由病理學(xué)專(zhuān)家判定。
1.4 統計學(xué)處理 采用SPSS11.0統計軟件包進(jìn)行分析，所得數據進(jìn)行四格表資料的χ2檢驗。P≤0.05為差異有顯著(zhù)性意義。
2 結果
實(shí)驗組正常結腸的神經(jīng)節細胞內可見(jiàn)空腸彎曲菌抗體與神經(jīng)節細胞結合的棕色顆粒,其陽(yáng)性率為83.3%；而對照組沒(méi)有發(fā)現空腸彎曲菌抗體結合的棕色顆粒,其陽(yáng)性率僅為10%,實(shí)驗組與對照組比較差異有統計學(xué)意義（χ2＝30.19，P＜0.01，圖1，表1）。
3 討論
腸神經(jīng)元發(fā)育異常是導致小兒頑固性便秘甚至腸梗阻的重要原因，其病因一直是人們爭論的熱點(diǎn)�，F在一般認為腸神經(jīng)元發(fā)育異常是由遺傳因素和環(huán)境因素（如毒素、炎癥、缺血缺氧等）多種原因導致的一種疾病，常常并發(fā)結腸炎癥［5］。研究發(fā)現細菌感染可能是導致此類(lèi)疾病并發(fā)小腸結腸炎的重要原因［6］。而致病細菌的具體種類(lèi)及與腸神經(jīng)系統損傷的因果關(guān)聯(lián)，目前并沒(méi)有深入研究。
空腸彎曲菌為革蘭陰性微需氧彎曲菌，被認為是引起全世界人類(lèi)細菌性腹瀉的主要原因之一,在世界各地和各個(gè)年齡組均有日益增長(cháng)的趨勢�？漳c彎曲菌感染的發(fā)病率呈雙峰型，以嬰幼兒和15～29歲年齡組最高，在發(fā)展中國家多集中在5歲以下（尤其是1歲以?xún)龋┑膬和�，我國最近的調查表明2歲以下小兒腹瀉空腸彎曲菌檢出率最高［3］。對空腸彎曲菌的致病機制的研究認為其致病因素包括黏附、侵襲、產(chǎn)生毒素和分子模擬機制等4個(gè)方面［7］。Schwerer等［8］研究表明空腸彎曲菌感染可以通過(guò)分子模擬機制引起外周神經(jīng)組織的損傷。動(dòng)物實(shí)驗證明，空腸彎曲菌體成分脂多糖核心低聚糖與神經(jīng)組織成分神經(jīng)節苷脂有相似的抗原性,當空腸彎曲菌感染機體后, 刺激機體免疫系統產(chǎn)生相應的空腸彎曲菌特異性抗體, 由于存在交叉反應,該抗體不僅與空腸彎曲菌體結合,同時(shí)也與神經(jīng)組織成份神經(jīng)節苷脂結合,引起局部神經(jīng)病理?yè)p傷［9］。神經(jīng)節苷脂是維持神經(jīng)元存活、生長(cháng)、分化和功能所必需的神經(jīng)營(yíng)養物質(zhì)。在正常發(fā)育過(guò)程中，神經(jīng)節苷脂可能參與神經(jīng)元的生長(cháng)、分化和表型的表達，以及細胞的遷移和神經(jīng)生長(cháng)錐的定向延伸。若神經(jīng)節苷脂功能失活，會(huì )導致細胞黏附分子與細胞膜的結合力下降，從而影響遷移 ,導致神經(jīng)元的發(fā)育異常［10］。神經(jīng)系統發(fā)育成熟以后，神經(jīng)節苷脂對其具有一定的保護、修復作用。
目前對于空腸彎曲菌導致外周神經(jīng)系統損傷的研究比較多，主要局限在格林-巴利綜合征上，對于空腸彎曲菌對腸道神經(jīng)系統有無(wú)損傷作用，通過(guò)什么機制導致腸道神經(jīng)系統損傷，并沒(méi)有深入的研究。本研究結果顯示空腸彎曲菌抗體在正常結腸神經(jīng)節細胞上的陽(yáng)性表達率為83.3％，說(shuō)明空腸彎曲菌抗體可以與腸道正常神經(jīng)節細胞結合，有導致神經(jīng)節細胞變性的可能。因而初步認為：在腸道神經(jīng)系統發(fā)育過(guò)程中，由于空腸彎曲菌存在的廣泛，并且容易傳播感染，導致患兒感染空腸彎曲菌；由于空腸彎曲菌腸炎在嬰幼兒時(shí)期癥狀多不明顯，導致大部分患兒病情被忽視，僅部分患兒產(chǎn)生小腸結腸炎表現�？漳c彎曲菌感染后，可能通過(guò)抗體的分子模擬機制，與神經(jīng)元的神經(jīng)節苷脂結合，影響神經(jīng)元生長(cháng)、分化、存活，從而阻礙腸道神經(jīng)節細胞的發(fā)育成熟，導致腸道功能障礙的發(fā)生。而對于腸道神經(jīng)系統發(fā)育成熟的患兒，空腸彎曲菌可以通過(guò)分子模擬機制，破壞對神經(jīng)元起保護作用的神經(jīng)節苷脂，使神經(jīng)節細胞更容易受到毒性產(chǎn)物的損害，導致神經(jīng)節細胞變性甚至壞死。但是僅通過(guò)本研究，并不能充分說(shuō)明空腸彎曲菌的抗體一定可以導致神經(jīng)節細胞變性，需要通過(guò)進(jìn)一步的臨床研究，來(lái)明確空腸彎曲菌抗體對腸道神經(jīng)節細胞的作用。
作者：韓克 李金良 李殿國 孫小兵 張麗 宋磊
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