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【摘要】 目的 深入研究腸球菌耐藥性的產(chǎn)生機制，指導臨床合理用藥。方法 采用一步誘導法，對8株糞腸球菌、2株屎腸球菌和9株糞腸球菌、1株屎腸球菌進(jìn)行四環(huán)素和左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性；用PCR法檢測四環(huán)素耐藥基因tetM、tetL，用PCR法擴增gyrA、parC基因后測定DNA序列。結果 10株實(shí)驗菌中的2株誘導產(chǎn)生了多株穩定的四環(huán)素耐藥株。耐藥株的MIC分別為16～128μg/ml，與原株（MIC0.25μg/ml、2μg/ml）比較，增加了16～512倍。在1株實(shí)驗菌的誘導耐藥株的質(zhì)粒DNA上檢測到tetL耐藥基因，另一株實(shí)驗菌株的誘導耐藥株的染色體DNA上檢測到tetM耐藥基因；10株實(shí)驗菌中的2株誘導產(chǎn)生了多株穩定的左氧氟沙星耐藥株。誘導耐藥株的MIC分別為16～64μg/ml，與原株（MIC 2μg/ml、2μg/ml）比較，增加了8～32倍。GyrA的QRDR內的第87位或第83位的氨基酸及ParC的 QRDR內的第80位的氨基酸均發(fā)生了改變。結論 一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗的結果表明，腸球菌可在高于耐藥MIC濃度的抗菌藥物短期作用后獲得耐藥性。
【關(guān)鍵詞】 腸球菌 抗菌藥物 誘導性耐藥 抗菌藥物壓力
近年來(lái)，腸球菌作為一種引起醫院感染的重要病原菌已經(jīng)引起了醫學(xué)界的廣泛關(guān)注。美國醫院感染監視系統(NISS)已將其列為引起醫院感染的第二大病原菌［1］。
腸球菌不僅具有天然耐藥性，而且更易被誘導產(chǎn)生新的耐藥性。Tankovic報告對環(huán)丙沙星耐藥的腸球菌由1987～1989年期間的不到2%增加到1991～1993年間的14%以上，而且是由該類(lèi)藥物在臨床上的應用增加所致［2］。在瑞典Huddinge醫院，對喹諾酮耐藥的腸球菌由1994年的11%增加到1997年的25%［3］。而國內1997～2001年期間臨床分離的腸球菌對環(huán)丙沙星耐藥率分別為糞腸球菌44.2%，屎腸球菌70.7%［4］。在美國，由于萬(wàn)古霉素的使用，1989～1993年間腸球菌對萬(wàn)古霉素的耐藥率增加了20倍。這些統計學(xué)臨床資料已經(jīng)顯示，抗菌藥物的臨床應用造成的藥物選擇性壓力可能是引起腸球菌耐藥性的產(chǎn)生與擴散的重要原因之一。
為深入探索腸球菌耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展，本課題就此進(jìn)行了部分抗菌藥物的實(shí)驗研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 實(shí)驗菌株TE1～TE10（TE3、TE9為屎腸球菌，其它為糞腸球菌）用于四環(huán)素誘導性耐藥試驗。實(shí)驗菌株LE1～LE10（LE2為屎腸球菌，其它為糞腸球菌）用于左氧氟沙星誘導性耐藥試驗。質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC 51299。
1.1.2 抗菌藥物 左氧氟沙星（LEV，5μg/片）、四環(huán)素(TCY，30μg/片)藥敏紙片購自Oxoid公司。四環(huán)素、左氧氟沙星粉劑購自中國生物制品研究所。
1.1.3 試劑 心腦浸液、M-H瓊脂，購自BECTON-DICKINSON公司。Vitek細菌鑒定卡及藥敏鑒定卡購自法國生物梅里埃公司。PCR引物由賽百盛公司合成。四環(huán)素耐藥基因tetM引物為5′-GAC ACG CCA GGA CAT ATG G-3′， 5′-TGC TTT CCT CTT GTT CGA G-3′；四環(huán)素耐藥基因tetL引物為5′-ATA AAT TGT TTC GGG TCG TTA AT-3′，5′-AAC CAG CCA ACT AAT GAC AAT GAT-3′；DNA消旋酶gyrA引物為5′-CGG GAT GAA CGA ATT GGG TGT GA-3′，5′-AAT TTTACT CAT ACG TGC TTC GG-3′；DNA消旋酶parC引物為5′-AAA CCT GTT CAG CGC CGC AT-3′，5′-TCG GTG TAA CGC ATT GCC GC-3′。
1.1.4 儀器設備 Vitek AMS-60全自動(dòng)細菌鑒定及藥敏系統（法國生物梅里埃公司）。AG-9600 AMPLISENSOR MINILYZER PCR擴增儀（美國）。
1.2 方法
1.2.1 實(shí)驗菌株的選擇 依據細菌鑒定及MIC結果，最終選擇對四環(huán)素敏感的8株糞腸球菌和2株屎腸球菌（MIC 0.25～4μg/ml）作為四環(huán)素誘導性耐藥的實(shí)驗菌株；對左氧氟沙星敏感的9株糞腸球菌和1株屎腸球菌（MIC 0.5～2μg/ml）作為左氧氟沙星誘導性耐藥實(shí)驗菌株。
1.2.2 藥物敏感性試驗 瓊脂稀釋法參照2002年NCCLS推薦的方法進(jìn)行操作及判讀結果，同時(shí)測定糞腸球菌ATCC29212、糞腸球菌ATCC 51299的MIC進(jìn)行質(zhì)控。
1.2.3 四環(huán)素誘導性耐藥試驗 采用一步法。參照文獻［5］及腸球菌對四環(huán)素耐藥的MIC界值，首先確定四環(huán)素誘導耐藥試驗的藥物濃度為20μg/ml、細菌接種量為107CFU/每個(gè)平板。將實(shí)驗菌制備成1×108CFU/ml菌懸液，取100μl菌懸液加入到含20μg/ml四環(huán)素的BHI瓊脂平板上，用無(wú)菌L形棒均勻涂布平板，35℃培養24h、48h、72h、96h、120h后觀(guān)察結果，并記錄生長(cháng)的菌落數。取培養后生長(cháng)出的菌落，純培養后制備1×108CFU/ml菌懸液，取100μl菌懸液涂布接種新鮮制備的含20μg/ml四環(huán)素的BHI瓊脂平板，35℃培養18～24h，觀(guān)察有無(wú)細菌生長(cháng)。在新鮮制備的及35℃分別放置了24、48、72、96和120h的含20μg/ml四環(huán)素的BHI瓊脂平板上，涂布接種100μl 1×108CFU/ml糞腸球菌ATCC29212及實(shí)驗菌懸液，于35℃培養18～24h后觀(guān)察有無(wú)菌落生長(cháng)。對誘導出的菌株用瓊脂稀釋法測定藥物敏感性，用PCR檢測tetL和tetM耐藥基因。
1.2.4 左氧氟沙星誘導性耐藥試驗 采用一步法。參照四環(huán)素誘導性耐藥試驗，首先確定左氧氟沙星誘導耐藥試驗的藥物濃度為10μg/ml。其余步驟基本同四環(huán)素誘導性耐藥試驗。此外，對部分誘導出的菌株的gyrA和parC基因擴增后，進(jìn)行DNA序列分析。
1.2.5 誘導性耐藥菌株的穩定性試驗 將誘導的耐藥菌接種在無(wú)抗菌藥物BHI肉湯中，35℃培養，每24h轉種一次，連續培養10代。然后進(jìn)行藥物敏感性測定。
1.2.6 耐藥基因測定 堿裂解法制備質(zhì)粒DNA、參照方法［6］制備染色體DNA。PCR反應體系100μl，含模板DNA約0.2μg，引物0.2μmol/L，0.2mmol/L dNTP，10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，2.5U TaqDNA聚合酶。耐藥基因DNA測序：將gyrA、parC和部分實(shí)驗菌株的tetL基因擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化后送北京華大中生科技發(fā)展有限公司測序部進(jìn)行DNA序列測定。測序結果對照基因庫檢索結果進(jìn)行分析。
2 結果
2.1 四環(huán)素誘導性耐藥試驗結果
2.1.1 誘導性耐藥培養結果 (1)實(shí)驗菌TE5和TE8在48h～120h培養過(guò)程中分別生長(cháng)了131、87個(gè)菌落。TE1～TE4、TE6～TE7、TE9～TE10實(shí)驗菌株在120h培養過(guò)程中，無(wú)菌落生長(cháng)。(2)將48～120h生長(cháng)的菌落再次以相同的菌量分別接種含四環(huán)素BHI瓊脂平板，24h培養后菌落融合生長(cháng)成菌膜。(3)在35℃已經(jīng)放置了24～120h的含四環(huán)素BHI瓊脂平板上，分別接種了TE5、TE8和ATCC29212，24h培養后無(wú)肉眼可見(jiàn)的菌落生長(cháng)。
2.1.2 誘導性耐藥菌株的藥物敏感性 隨機選擇的48h和72h生長(cháng)出的誘導菌株全部為四環(huán)素單耐藥株，與原株相比，TE5、TE8誘導株的MIC分別增加了64～512和16～64倍。藥敏結果詳見(jiàn)表1。將誘導的耐藥菌株在BHI肉湯中進(jìn)行連續10天的傳代培養后測定MIC，結果與傳代前比較無(wú)明顯改變。
表1 四環(huán)素誘導的菌株的耐藥性
注：TE521、TE522、TE821、TE822分別為實(shí)驗菌株TE5和TE8的48h誘導耐藥株；TE531、TE831、TE532、TE832分別為實(shí)驗菌株TE5和TE8的72h誘導耐藥株。
2.1.3 誘導性耐藥菌株耐藥基因的檢測 對原株、耐藥菌株TE521，TE821；TE531，TE831；TE532，TE832，經(jīng)PCR擴增檢測四環(huán)素耐藥決定子tetL、tetM。結果在 TE5及誘導耐藥株的質(zhì)粒DNA上檢測到tetL，在TE8誘導耐藥株的染色體DNA上檢測到tetM。對TE5、TE521的tetL基因進(jìn)行了測序，其結果與Genbank中的序列同源性為99%，TE5與TE521的序列完全一致。
2.2 左氧氟沙星誘導耐藥性試驗結果
2.2.1 誘導性耐藥培養結果 (1)實(shí)驗菌株LE1，LE5在48h～120 h培養過(guò)程中分別生長(cháng)了54、48個(gè)菌落。LE2～LE4、LE6～LE10實(shí)驗菌株在120h培養過(guò)程中，無(wú)菌落生長(cháng)。(2)48～120h生長(cháng)的菌落再次以相同的菌量接種含左氧氟沙星BHI瓊脂平板，24h培養后生長(cháng)成菌膜。(3)在35℃已經(jīng)放置了24～120h的含左氧氟沙星BHI瓊脂平板上，分別接種了1×107CFU/平板的LE1、LE5和ATCC29212，在24h培養后無(wú)肉眼可見(jiàn)的菌落生長(cháng)。
2.2.2 誘導性耐藥菌株的耐藥性 誘導獲得的耐藥菌株全部為左氧氟沙星單耐藥菌株，與原株相比，LE1、LE5誘導耐藥株的MIC分別增加了16～32倍和16倍。將誘導的耐藥菌株在BHI肉湯中進(jìn)行連續10天的傳代培養后測定MIC，結果與傳代前比較無(wú)明顯改變。結果詳見(jiàn)表2。
表2 左氧氟沙星誘導的菌株的耐藥性
注：LE121、LE131、LE141分別為實(shí)驗菌株LE1在48h、72h和96h誘導培養后生長(cháng)的菌株；LE521、LE531、LE541分別為實(shí)驗菌株LE5在48h、72h和96h誘導培養后生長(cháng)的菌株。
2.2.3 誘導性耐藥菌株的耐藥基因檢測 對原株、耐藥菌株LE121，LE521；LE131，LE531；LE141，LE541和標準菌株ATCC51299、ATCC29212，分別經(jīng)PCR擴增gyrA和garC。結果全部菌株均在擴增產(chǎn)物的電泳圖譜上出現了241bp的gyrA和248bp的parC條帶。gyrA經(jīng)測定DNA序列，LE121的喹諾酮耐藥決定區（QRDR）內的第87位的谷氨酸(密碼子GAA)置換為賴(lài)氨酸(密碼子AAA)。LE131 QRDR內的第83位的絲氨酸(密碼子AGT)置換為異亮氨酸(密碼子ATT)。LE141 QRDR內的第83位的絲氨酸(密碼子AGT) 置換為精氨酸(密碼子AGA)。LE521、LE531、LE541 QRDR內的第87位的谷氨酸(密碼子GAA)均置換為賴(lài)氨酸(密碼子AAA)。parC經(jīng)測定DNA序列，LE1和LE5的誘導耐藥株與原株比較，parC 編碼的蛋白質(zhì)QRDR內的第80位的絲氨酸(密碼子AGT)均置換為異亮氨酸（密碼子ATT）。結果詳見(jiàn)表3、表4。
表3 左氧氟沙星誘導的耐藥菌株的gyrA序列改變
表4 左氧氟沙星誘導的耐藥菌株的parC序列改變
3 討論
在一步法抗菌藥物誘導性耐藥試驗中，分別接種了1×107CFU實(shí)驗菌于含高于耐藥MIC濃度的左氧氟沙星BHI瓊脂平板和四環(huán)素BHI瓊脂平板上，實(shí)驗菌株在24h培養后均無(wú)肉眼可見(jiàn)的菌落生長(cháng)，表明腸球菌對左氧氟沙星和四環(huán)素耐藥菌株的自發(fā)突變率一般低于1×10-7。48h后誘導生長(cháng)的菌株再次接種含抗菌藥物BHI瓊脂平板，則于24h培養后生長(cháng)成菌膜，表明為非緩慢生長(cháng)的腸球菌。實(shí)驗菌株和ATCC29212接種在35℃已預先放置了24～120h的含抗菌藥物BHI瓊脂平板上，培養24h后無(wú)菌落生長(cháng)，示誘導生長(cháng)的菌株不是因為培養基中的抗菌藥物活性下降所致。藥物敏感性測定結果表明誘導后生長(cháng)的菌株均單獨對左氧氟沙星或四環(huán)素耐藥。以上結果表明分別在含左氧氟沙星或四環(huán)素的BHI瓊脂平板上，于48h后生長(cháng)的菌株均應為藥物誘導產(chǎn)生的耐藥菌株。
腸球菌對喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的主要機制是由于DNA促旋酶A亞單位（gyrA）和拓撲異構酶Ⅳ（parC）基因突變引起。一般認為parC為腸球菌對喹諾酮類(lèi)藥物耐藥的第一突變基因，低中水平耐藥一般僅有parC突變，高水平耐藥常既有parC突變，又有g(shù)yrA的突變，尚未發(fā)現僅有g(shù)yrA突變而無(wú)parC突變的腸球菌耐藥菌株。本實(shí)驗中誘導的耐藥株未見(jiàn)gyrA編碼的蛋白質(zhì)QRDR內的第83和87位氨基酸，或parC 編碼的蛋白質(zhì)QRDR內的第80和84位氨基酸同時(shí)發(fā)生改變的誘導耐藥株。此結果與文獻報道類(lèi)似［7］。
腸球菌對四環(huán)素的主要耐藥機制為產(chǎn)生外排蛋白和核糖體保護因子，其中最主要、最常見(jiàn)的2種耐藥決定子為tetL、tetM。本實(shí)驗誘導的四環(huán)素耐藥株的PCR擴增結果顯示，TE8實(shí)驗株的誘導耐藥株全部含有tetM耐藥決定子，而未檢測到tetL耐藥確定子。TE5實(shí)驗株及其誘導耐藥株全部檢測到tetL，而未檢測到tetM。TE5實(shí)驗株為四環(huán)素敏感菌株，其MIC為0.25μg/ml，但在其質(zhì)粒中檢測到tetL耐藥決定子，此種基因型和耐藥表型不一致的現象尚未見(jiàn)報道。推測可能為某種因素抑制了tetL的表達，經(jīng)四環(huán)素作用后，解除了對tetL表達的抑制，進(jìn)而對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥。
本研究中對誘導的耐藥菌株耐藥基因的檢測結果表明，實(shí)驗誘導的耐藥菌株的基因型與臨床分離的腸球菌基本一致，這不僅從分子水平進(jìn)一步證明了本研究中抗菌藥物作用下生長(cháng)的菌落為耐藥菌株，而且從某種程度上顯示臨床耐藥菌株的產(chǎn)生和擴散與抗菌藥物的使用確實(shí)密切相關(guān)。
已有的大量文獻表明臨床上廣泛應用和濫用抗菌藥物是引起細菌耐藥性產(chǎn)生和發(fā)展的主要原因之一。本研究通過(guò)體外實(shí)驗證實(shí)了腸球菌可在高濃度的抗菌藥物作用后獲得耐藥性。因此在臨床抗感染治療中應該合理使用抗菌藥物。
作者：劉貴建 許淑珍《中華實(shí)用醫藥雜志》
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