腸球菌溶血素的表型及基因型檢測

【摘要】  目的觀(guān)察大鼠全腦照射后海馬區腫瘤壞死因子α（TNF�拨�）的動(dòng)態(tài)表達，探討其在放射性腦損傷急性期的反應發(fā)病機理中可能的作用。方法制備大鼠的腦放射誘導損傷模型。利用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT�睵CR）技術(shù)半定量分析大鼠腦放射誘導損傷后海馬區在不同時(shí)間、不同劑量水平TNF�拨�基因轉錄的動(dòng)態(tài)表達。結果正常組海馬區TNF�拨� mRNA低水平表達；全腦照射組表達上調并在1 h達峰值，是正常組的4～11倍（P<0.001）；放射誘導呈劑量依賴(lài)性（P<0.01），30 Gy組較2 Gy組增高近2倍（P<0.001），較15 Gy組增高近1倍（P<0.01），15 Gy組也高于2 Gy組；各照射組在12 h后恢復到基礎水平。結論大鼠全腦照射后海馬區TNF�拨�基因表達上調，放射誘導呈劑量依賴(lài)性，提示參與了腦放射誘導損傷急性期的細胞反應。

【關(guān)鍵詞】  腫瘤壞死因子α 腦損傷 海馬 疾病模型 動(dòng)物

    放射性腦損傷是頭頸部腫瘤提高放射治療療效的重要障礙之一，一些亞急性期和晚期并發(fā)癥的影像學(xué)和組織學(xué)變化已比較明確，但急性期的細胞和分子反應以及如何進(jìn)展為晚期損傷的機理目前尚不清楚。已有實(shí)驗證實(shí)誘發(fā)腦損傷的一個(gè)重要因素是細胞因子的過(guò)度表達，損傷特征性變化如腦水腫、神經(jīng)膠質(zhì)增生及脫髓鞘都與前炎性細胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)[1]。腫瘤壞死因子α（TNF�拨�）是一種典型的細胞因子，在各種損傷反應的分子網(wǎng)絡(luò )中都有重要作用，如在腦放射誘導損傷各反應期都可觀(guān)察到與其它細胞因子不同的變化[2]。筆者觀(guān)察大鼠腦放射誘導損傷后海馬區TNF�拨� mRNA的動(dòng)態(tài)表達，探討其在放射性腦損傷早期的反應機制中可能的作用。

    1材料與方法

    1.1動(dòng)物

    1.1.1模型制作6～8周齡SD雌性大鼠100只由廈門(mén)大學(xué)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號為SCXK（滬）2004��0005]，體質(zhì)量(200±20)g。腦放射誘導損傷模型參照文獻[3]制作。3.6%水合氯醛按1 mL/100 g麻醉，予直線(xiàn)加速器4 MeV電子線(xiàn)全腦照射，照射范圍包括雙眼至耳根區域。

    1.1.2分組按不同單次照射劑量2，15，30 Gy和照射后不同觀(guān)察時(shí)間1，6，12，24，48 h和7 d分為18組，另設假照射組（麻醉后不進(jìn)行照射）和正常組（不麻醉不照射）為對照，共計20組，每組5只。斷頭處死后隨機取一側海馬，立即置于無(wú)RNA酶的Ep管中，-196 ℃液氮保存。

    1.2方法

    1.2.1總RNA的提取按說(shuō)明書(shū)用Trizol試劑(上海生物工程公司)提取總RNA。經(jīng)紫外分光光度計測定D（260 nm）/D（280 nm）在1.7～2.0，計算總RNA含量，電泳證實(shí)18 S和28 S條帶清晰。

    1.2.2逆轉錄合成cDNARNA 2 μg以Oligo(dT)18為引物，20 μL反應體系在70 ℃預變性5 min；再加入5×RT buffer、dNTP、RNasin和MMLV共40 μL，體系在37 ℃反應45 min。

    1.2.3PCR擴增取cDNA 5 μL用于擴增。50 μL反應體系中加入10×buffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、正義和反義引物。PCR的反應條件為94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，共33個(gè)循環(huán)。以β�瞐ctin為內參照，擴增產(chǎn)物7.5 μL和β�瞐ctin 5 μL混合在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果采用計算機數字掃描密度影像分析儀進(jìn)行半定量分析。PCR所采用的引物根據Genebank及軟件設計,由上海生物工程公司合成。序列如下：

    TNF�拨�（438 bp）：

    F：5′GGT GAT CGG TCC CAA CAA GG3’

    R：5′CCT CCC AGG TAC ATG GGC TC3’

    β�瞐ctin （332 bp）：

    F：5′CTG GAG AAG AGC TAT GAG C3’

    R：5′AGG ATA GAG CCA CCA ATC C3’

1.3統計學(xué)處理以?xún)葏⒄?SPAN lang=EN-US>β�瞐ctin光密度值標化TNF�拨�光密度值，得到TNF�拨�的相對含量，結果用x±s表示。應用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統計分析。對時(shí)間和照射劑量作雙因素F檢驗，對有顯著(zhù)差異組樣本均數作t檢驗。

2結果

    全腦照射前海馬區TNF�拨� mRNA表達維持在低水平，照射后基因表達上調（P<0.001），隨照射劑量的增加而增高（P<0.001），在1 h達高峰，是正常組的4～11倍，6 h仍顯著(zhù)高于正常，12 h后表達均恢復到基礎水平，在7 d內未見(jiàn)再次上升；在6 h時(shí)間點(diǎn)15 Gy組數值較2 Gy和30 Gy組低，差別有統計學(xué)意義。照射組與正常組、假照射組比較，結果相同，提示麻醉不影響實(shí)驗結果（圖1，表1）。 表1大鼠全腦照射后海馬區TNF�拨�表達

    3討論

    大腦腫瘤的放射治療可能會(huì )伴隨發(fā)生亞急性和晚期并發(fā)癥的危險，其病理特征是脫髓鞘、神經(jīng)元缺失、脈管系統損害和神經(jīng)膠質(zhì)增生。并發(fā)癥的程度因照射劑量、靶體積、人種和其他因素的不同而不同。盡管這些并發(fā)癥在照射后需要一定的時(shí)間才有表現，但在無(wú)癥狀期觀(guān)察到的細胞反應可能對決定這種最終結果發(fā)揮重要作用[2,4]。動(dòng)物模型顯示放射可以誘發(fā)腦內周期性的細胞級聯(lián)變化，包括持續數天至數月的神經(jīng)膠質(zhì)增生、導致脫髓鞘變化的少突膠質(zhì)細胞缺失及血腦屏障損害,這些變化都與前炎性細胞因子的產(chǎn)生密切相關(guān)[1]。TNF�拨�作為一種重要的前炎性細胞因子在上述條件下均可觀(guān)察到明顯的變化，故目前一致認為它參與了損傷與修復過(guò)程[5]。

    已有的文獻資料認為，鼠腦放射的平均致死劑量（LD50）為32.4 Gy[1]，而在腦腫瘤立體定向放射治療中也經(jīng)常應用此范圍的單次劑量。本實(shí)驗選擇2，15，30 Gy 3個(gè)不同的劑量點(diǎn)也是基于此考慮。結果顯示，照射前海馬區TNF�拨�基因表達維持在低水平，照射后表達上調，峰值在照射后1 h，是正常組的4～11倍，6 h表達仍顯著(zhù)高于正常，12 h后恢復到基礎水平；水合氯醛麻醉處理并不增加TNF�拨�的表達。盡管在6 h時(shí)間點(diǎn)15 Gy組數值較2 Gy和30 Gy組低，差別有統計學(xué)意義，提示仍有劑量依賴(lài)性，可能為實(shí)驗誤差。文獻報道腦放射誘導損傷后細胞因子上升峰值時(shí)間在2～8 h，24 h后恢復正常[4��6]。而本實(shí)驗的峰值時(shí)間和恢復時(shí)間都較之提前，可能與腦照射體積擴大、損傷加重和修復加快有關(guān)。Chiang等的結果顯示，即使低劑量輻射條件下也可觀(guān)察到TNF�拨�、IL��1基因表達上調及蛋白含量升高[6]。Hong等報道腦放射誘導損傷后急性期前炎性細胞因子基因表達增高，峰值在4，24 h后恢復，這種變化可被皮質(zhì)激素抑制[4]。

    很多假說(shuō)認為，大腦在受到電離輻射后過(guò)度表達的細胞因子和免疫調節分子可能參與了血管通透性增高、細胞毒性、星形細胞增生和神經(jīng)膠質(zhì)增殖的變化[4��5]。TNF�拨�作為一種典型的前炎性細胞因子，由單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和巨細胞刺激后產(chǎn)生，但近來(lái)發(fā)現星形細胞、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元也是來(lái)源之一[3，6]。TNF�拨�在低水平表達時(shí)作為免疫系統的中間介質(zhì)保護宿主免于各種感染和癌細胞的攻擊，通過(guò)凋亡機制誘導癌細胞發(fā)生程序化死亡[7]，保護神經(jīng)元免于興奮性氨基酸的毒性[8]。而在表達增高時(shí)TNF�拨�則表現出明顯的致病效應，在各種損傷刺激的分子網(wǎng)絡(luò )中TNF�拨�均是一個(gè)重要的細胞因子，其表達水平的上調將誘發(fā)更廣泛的分子級聯(lián)反應，如誘導IL��1、IL��6和ICAM��1的表達，最終引起臨床癥狀[9��10]。筆者實(shí)驗中討論的是單次劑量照射條件下的分子變化，至于分次照射的反應，已有學(xué)者報道首次照射將誘發(fā)腦細胞發(fā)生脫敏效應，不應期的存在使得間隔24 h后的放射誘導損傷較前一次明顯減輕[11]。

全腦照射后海馬區TNF�拨�的表達明顯增加并很快達峰值，隨劑量增加而增高，24 h內恢復正常。筆者認為TNF�拨�參與了放射性腦損傷的進(jìn)程，如果能了解損傷急性期的分子機制并加以干預，無(wú)論是對減輕治療反應還是預防晚期并發(fā)癥都是有益的。

 作者：強華 劉光英 李能《福建醫科大學(xué)學(xué)報》

【參考文獻】
  [1]Chiang C S,McBride W H,Withers H R, et al. Radiation�瞚nduced astrocytic and microglial responses in mouse brain[J]. Radiother Oncol, 1993,29:60��68.
[2]Chiang C S,Hong J H,Stalder A, et al. Delayed molecular responses to brain irradiation[J]. J Radiat Biol, 1997,72:45��53.
[3]田野,包仕堯,殷蔚伯. 大鼠半腦照射后早期腦內血流量和含水量變化的研究[J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 1999,8:43��46.
[4]Hong J H,Chiang C S,Campbell I L, et al. Induction of acute phase gene expression by brain irradiation[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1995,33(3):619��626.

[5]Kureshi S A,Hofman F M,Schneider J H, et al. Cytokine expression in radiation�瞚nduced delayed cerebral injury[J]. Neurosurgery, 1994,35:822��830.
[6]Chiang C S,McBride W H. Radiation enhances tumor necrosis factor alpha production by murine brain cells[J]. Brain Res, 1991,566:265��269.
[7]Wang C Y,Mayo M W,Baldwin A S, et al. TNF and cancer therapy induced apoptosis: Potentiation by inhibition of NF�拨蔅 [J]. Science, 1996,274:784��787.
[8]Cheng B,Christakos S,Mattson M P, et al. Tumor necrosis factors protect neurons against metabolic�瞖xcitotoxic insults and promote maintenance of calcium homeostasis[J]. Neuron, 1994,12:139��153.
[9]Chen T C,Hinton D R,Apuzzo M L, et al. Differential effects of tumor necrosis factor alpha on proliferation, cell surface antigen expression, and cytokine interactions in malignant gliomas[J]. Neurosurgery, 1993,32:85��94.
[10]Kyrhanides S,Olschowka J A,Williams J P, et al. TNF�拨� and IL��1β mediate intercellular adhesion molecule��1 induction via microglia�瞐strocyte interaction in CNS radiation injury[J]. J neuroimmunol, 1999,95:95��106.
[11]Raju U,Gumin G J,Tofilon P J, et al. NF�拨蔅 activity and target gene expression in the rat brain after one and two exposures to ionizing radiation[J]. Radiat Oncol Invest, 1999,7:145��152.

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