奶粉中阪崎腸桿菌分離株表型特征分類(lèi)

阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)屬于腸桿菌屬的1個(gè)新種［1］。本文采用目前應用最廣、在微生物鑒定方面得到公認的腸桿菌科細菌生化鑒定試劑(API20E)分析了阪崎腸桿菌的生化反應特性，并利用陰溝腸桿菌噬菌體進(jìn)行裂解試驗測定了阪崎腸桿菌的易感性，對奶粉中18株阪崎腸桿菌分離株和4株美國典型菌種保藏中心(ATCC)參考菌株進(jìn)行了表型分類(lèi)。旨在對奶粉中阪崎腸桿菌分離株的表型特征進(jìn)行分類(lèi)，以便準確地對其鑒別�，F報告如下。

　　1   材料與方法

　　1��1   材料   (1)標準菌株：阪崎腸桿菌ATCC29544，ATCC29004，ATCC51329，ATCC12868。(2)阪崎腸桿菌分離株：分離自國內市場(chǎng)奶粉抽查樣品，共18株。經(jīng)AP120E和英國熒光快速微生物鑒定／藥敏分析儀，2種系統對阪崎腸桿菌的鑒定概率(％)。檢驗檢疫菌種保藏中心(IQCC)10403-1(98��4，98��48)；10403-2(98，94��89)；10403-3(98��4，99��95)；10403-4(98��4，92��30)；10403-5(98，92��37)；10403-6(98，99��35)；10403-7(98��4，99��3)；10403-8(98��4，97��96)；10403-9(98，97��26)；10403-10(98��4，95��96)；10403-11(98，99��6)；10403-12(98��4，99��26)；10403-13(98，99��26)；10403-14(98，100)；10403-16(98��4，99��51)；10403-17(98，98��22)；10403-18(98，99��35)；10403-23(98，99��6)。(3)試劑與培養基：腦心浸液肉湯(BHI)(美國Difico公司)；胰酪胨大豆胨瓊脂(TSA)、營(yíng)養瓊脂(北京陸橋公司)；API20E(法國生物梅里埃公司)；陰溝腸桿菌噬菌體(廣州虎克生物技術(shù)有限公司)。

　　1��2   方法

　　1��2��1   菌株培養   將每株參考菌株和分離菌株分別接種于滅菌BHI肉湯，36℃培養24h，再接種于TSA斜面，36℃培養24h，作為儲備菌株，試驗時(shí)從儲備菌株用接種環(huán)接種于營(yíng)養瓊脂，劃線(xiàn)分離37℃培養24h形成單菌落。

　　1��2��2   阪崎腸桿菌的生化特征及噬菌體裂解實(shí)驗   API20E實(shí)驗：將試驗菌株，按照API20E使用說(shuō)明進(jìn)行操作，36℃培養22～24h后，按照說(shuō)明書(shū)滴加相關(guān)試劑，觀(guān)察和記錄結果。噬菌體裂解實(shí)驗：接種針輕點(diǎn)生長(cháng)于營(yíng)養瓊脂上的單個(gè)純菌落，通過(guò)管壁研磨使其均勻分散在2ml普通肉湯中，約100CFU／ml，取1接種環(huán)(約100μl)菌懸液涂布于經(jīng)過(guò)預處理(90mm，20ml，放42～44℃恒溫箱30min使表面干燥)的營(yíng)養瓊脂表面，干燥(同前)，取100μl陰溝腸桿菌噬菌體滴加于營(yíng)養瓊脂表面，36℃培養22～24h，觀(guān)察裂解結果，以融合裂解、不完全裂解和不裂解記錄實(shí)驗結果。

　　1��2��3   阪崎腸桿菌的表型特征分類(lèi)   以ATCC參考菌株在API20E上反應的生化特征為生物1型，對于阪崎腸桿菌分離株，去掉相同的生化反應，保留不一致的生化反應項目進(jìn)行分析，每1種與參考菌株不同的生化特性為1種新的表型。

　　2   結果

2��1   API20E測定結果   API20E共有21項生化反應，主要區別在于伏-普試驗(VP)、肌醇和山梨醇方面，4株ATCC參考菌株生化反應一致，鑒定數值為3305373，7株分離株與參考菌株一致(38��9％)，將參考菌株的表型特征定義為生物1型，按照伯杰氏細菌手冊分類(lèi)方法［2］，VP、肌醇、山梨醇分別為+、+、-，與生物1型相比，肌醇陰性為3株，比例為16��7％，為生物2型；VP陰性9株，比例為50％，為生物3型；山梨醇陽(yáng)性2株，比例為11��1％，為生物4型；尿素陽(yáng)性，1株，比例為5％，為生物5型；精氨酸陰性1株，比例為5％，為生物6型。

2��2   陰溝腸桿菌噬菌體裂解實(shí)驗   4株ATCC阪崎腸桿菌參考菌株和18株分離菌株經(jīng)陰溝腸桿菌噬菌體裂解實(shí)驗，1株分離株被融合裂解，編號為IQCC10403-18，1株為不完全裂解，編號為IQCCl0403-13。

　　3   討論

　　1999年，Nazarowec-white和Farber對臨床和食品中分離到的17株阪崎腸桿菌以及1株ATCC29544進(jìn)行了表型特征分類(lèi)［3］，以ATCC29544參考菌株表型反應作為生物1型，與該生化反應模式比較，山梨醇陽(yáng)性反應株列為生物2型，VP陰性為生物3型。 本實(shí)驗采用此方法，對22株(包括4株ATCC參考菌株)進(jìn)行分析，但實(shí)驗結果存在差異。首先，ATCC參考菌株反應數值為3305373，而不是3304373，也即差異在VP實(shí)驗。本實(shí)驗4株參考菌株VP反應均為陽(yáng)性，經(jīng)典考夫曼方法重復實(shí)驗結果也為陽(yáng)性，伯杰氏手冊中阪崎腸桿菌的VP反應陽(yáng)性率為90%～100％［2］，臨床微生物學(xué)手冊為≥90％［4］。但本實(shí)驗的分離株VP陽(yáng)性率為50％，這可能與VP實(shí)驗結果判斷臨界點(diǎn)有關(guān)。本實(shí)驗之所以進(jìn)行陰溝腸桿菌噬菌體裂解實(shí)驗，是因為阪崎腸桿菌在1984年前屬于陰溝腸桿菌，包括參考菌株在內的22株菌，有2株分離株能被陰溝腸桿菌噬菌體裂解，這2株均產(chǎn)黃色素，API20E鑒定為阪崎腸桿菌的概率為98％，英國先德熒光快速微生物鑒定／藥敏分析儀鑒定為阪崎腸桿菌的概率>99％。此外，還出現尿素反應陽(yáng)性和精氨酸反應陰性的阪崎腸桿菌菌株，在對阪崎腸桿菌的鑒別中值得注意。

 作者：趙貴明，仉慶文，蔡雪《中國公共衛生》

【參考文獻】
  　　〔1〕 Joshua B Gurtler,Jeffrey L Kornacki,Larry R Beuchat.Enterobacter sakazakii:A coliform of increased concern to infant health［J］.International Journal ofFood Microbiology,2005,104(1):1-34.　　
　　〔2〕 李蓉，徐迪誠.微生物分類(lèi)和鑒定技術(shù)進(jìn)展［M］.上海：光明日報出版社，1989：39-46.
　　〔3〕 M,Nazarowec-white,JM Farber.Phenitypic and genotypic typing of food and clinical isolates of Enterobacter sakazakii［J］.J Med Microbiology,1999,48(3):559-567.
　　〔4〕 徐建國，梁國棟，邢來(lái)君，等(譯).臨床微生物學(xué)手冊［M］.7版.北京：科學(xué)出版社，2005:678.

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