大腸桿菌變種的分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展

大腸桿菌是最常見(jiàn)的微生物之一，在自然界廣泛分布，在動(dòng)物體內也存在。它具有易培養、生長(cháng)快、易變異等特點(diǎn)。腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic E. coli，EHEC)是大腸桿菌的一個(gè)變種，曾在多個(gè)國家暴發(fā)流行。目前美國、加拿大等國家也出現了新的耐藥性變種［1］，導致了多人死亡。因此大腸桿菌致病變種引起了國內外學(xué)者的密切關(guān)注，并對大腸桿菌變種進(jìn)行了深入的研究。筆者以EHEC血清型O157：H7為例，對它的分子生物學(xué)檢測方法進(jìn)行綜述，為對該菌引起的疾病進(jìn)行預防、診斷和治療提供參考依據。

    大腸桿菌 O157：H7 曾多次在世界各地，特別是發(fā)達國家引起廣泛的暴發(fā)流行。感染主要導致腹瀉、出血性結腸炎(hemorrhagic colitis，HC)，并經(jīng)常伴發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syndrome，HUS)、血栓形成的血小板減少性紫癜( thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP) 并發(fā)癥，嚴重威脅著(zhù)人類(lèi)的生命健康［2］。人類(lèi)感染此菌的途徑主要是食用或接觸污染的牛肉、蔬菜、水果及水源等。
   
　　EHEC菌株能產(chǎn)生毒素，編碼這些毒素的基因包括志賀菌素1基因(st x1)、志賀菌素2基因(st x2)、大腸桿菌粘附與消除基因(eae)和腸溶血素基因(ehx)等。大腸桿菌O157:H7是與人類(lèi)疾病相關(guān)的最常見(jiàn)血清型細菌。1982年，美國學(xué)者首次從出血性腹瀉患者的糞便標本中分離到該菌，并報道與食用漢堡牛肉餅有關(guān)。這是人類(lèi)第一次認識到大腸桿菌O157:H7可作為一種病原菌使人類(lèi)致病，但當時(shí)并沒(méi)有引起醫學(xué)界的足夠重視。此后，大腸桿菌O157:H7引起的感染在美國、加拿大、英國和日本等發(fā)達國家迅速增加,逐漸引起廣泛重視。我國于1987年由權太叔等首次從出血性結腸炎患者糞便中分離到O157:H7大腸桿菌。此后，福建、浙江、廣東、河北、寧夏等十幾個(gè)省陸續分離出該菌。為防止類(lèi)似事件出現，1997年5月建立了全國O157:H7大腸桿菌檢測網(wǎng)絡(luò )。
   
　　大腸桿菌O157:H7對人的致病力較強，每克感染載體含菌10個(gè)以上即可能引起感染。因此，在流行病學(xué)調查中，特異、靈敏及快速檢測O157:H7的方法顯得尤為重要。隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，使得快速、準確檢測O157:H7成為可能，并為該領(lǐng)域的研究開(kāi)拓了更廣闊的前景。

　　2.1 聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù) 

　　該技術(shù)是最常用的檢測大腸桿菌O157:H7致病基因的方法。目前已從單一PCR發(fā)展到多重PCR乃至實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RQ- PCR ）。Paton 等［3］采用多重PCR 方法擴增st x1 、st x2、eae、ehxA和saa基因，發(fā)現所檢測的ETEC(大腸桿菌O157:H7是其中一種)中，有幾種或全部為致病基因。Fey 等［4］ 對335份腹瀉患者的糞便樣品進(jìn)行選擇性細菌培養，再從中選擇可疑菌落進(jìn)行檢測。用多重PCR的方法檢測到14株ETEC，與聯(lián)合應用傳統的細菌分離培養和酶免疫法(enzyme immunoassay，EIA)相比，分離的菌株數相同。從而證明，PCR是一種與細菌常規分離培養和EIA聯(lián)合應用、具有相同敏感性和特異性的方法。由于其速度快，可作為一種診斷由EHEC感染引起腹瀉的替代方法。

    近年來(lái)，隨著(zhù)RQ-PCR的發(fā)展，這種技術(shù)也被用于大腸桿菌O157:H7的檢測。RQ-PCR是利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴增反應中每一個(gè)循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標準曲線(xiàn)的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。常規PCR技術(shù)只能對PCR擴增反應的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對起始模板準確定量，也無(wú)法對擴增反應進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。RQ-PCR通過(guò)對引物、探針或擴增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標記使對積累的擴增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測成為可能。Ct值即PCR擴增過(guò)程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴增循環(huán)次數，模板DNA量越多，熒光達閾值的循環(huán)數越少，即Ct值越小。朱海等［5］使用RQ-PCR檢測生果、蔬菜中大腸桿菌O157∶H7，說(shuō)明熒光定量PCR檢測方法比傳統分離培養法靈敏度更高。Bellin等［6］在45min內用這種方法檢測了32個(gè)EHEC菌株中的st x1和st x2基因，證明實(shí)時(shí)定量PCR是一種快速檢測EHEC的方法。同時(shí)，該試驗對重復結果為陰性的試驗也較為迅速。

    因此，這種方法在處理大量懷疑含大腸桿菌O157:H7樣品時(shí)可使用，如在臨床微生物中糞便分析或食品安全性檢驗中的應用。

    運用PCR方法檢測與疾病相關(guān)的毒素基因還有助于對疾病發(fā)病機理的了解。有研究表明［6］，從ETEC感染患者體內分離的EHEC中，大部分含有與毒力相關(guān)的90kb質(zhì)粒編碼的ehxA基因。從引起出血性腸炎和HUS患者體內分離的EHEC中含有st x2和eae基因，而從無(wú)癥狀攜帶者分離的EHEC缺少eae基因，說(shuō)明缺少eae基因也就使ETEC缺乏了腸上皮細胞的粘附機理。

　　2.2  限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(RFLP) 

　　RFLP是根據不同樣品(個(gè)體)基因組或某個(gè)基因的限制性?xún)惹忻傅拿盖形稽c(diǎn)之間發(fā)生了堿基的替換、重排、插入、缺失等，導致產(chǎn)生新的限制性酶切位點(diǎn)或丟失某些酶切位點(diǎn)。新切點(diǎn)的出現可使限制性片斷的長(cháng)度縮短，而舊切點(diǎn)的丟失可使限制性片斷的長(cháng)度增大。通過(guò)基因的PCR擴增、限制性?xún)惹忻该盖泻铜傊�糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外光下直接觀(guān)察，可比較不同樣品(個(gè)體)DNA水平的差異(即多態(tài)性)。RFLP是目前細菌亞分類(lèi)最常用的方法之一，該法也被成功用于大腸桿菌O157:H7的多態(tài)性分析。Zhang等［7］用PCR-RFLP對從人分離的大腸桿菌st x1基因的變化情況進(jìn)行了分析，從有腹瀉癥狀的患者分離的大腸桿菌中檢測到st xB1，無(wú)癥狀攜帶者分離的大腸桿菌中檢測到st xB1的等位基因(命名為st xB1c ) 。用限制性?xún)惹忻窮spⅠ酶切282bp 的st xB1及st xB1c、st xB1 酶切的結果得到189bp和93bp兩個(gè)片段；st xB1c沒(méi)有被切開(kāi)，用限制性?xún)惹忻窰haⅠ進(jìn)行酶切，st xB1得到135bp、92bp和55bp 3個(gè)片段；st xB1c得到218bp和64bp兩個(gè)片段。選擇包括EDL933 的共6個(gè)菌株(均有st x1)作對照試驗，酶切的結果與st xB1一致。從上述結果可見(jiàn)，只運用PCR技術(shù)無(wú)法解釋相同病原菌編碼相同基因引起感染卻出現不同癥狀的情況，RFLP 方法為大腸桿菌O157致病機理的研究提供了一條更加有效的途徑。

　　2.3  隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD) 

　　RAPD建立在PCR基礎上，使用一系列具有10個(gè)堿基的單鏈隨機引物，對基因組的DNA全部進(jìn)行PCR擴增，以檢測其多態(tài)性。分析時(shí)所用引物數很大，雖對每一個(gè)引物而言，其檢測基因組的DNA多態(tài)性區域有限，但利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此，RAPD可以對整個(gè)基因組DNA 進(jìn)行多態(tài)性檢測。目前該項技術(shù)也被用于大腸桿菌O157:H7的多態(tài)性檢測。Radu等［8］對從15份牛肉和3份雞肉樣品中分離出的28株O157:H7分別進(jìn)行RAPD和PFGE分析，并繪制了進(jìn)化樹(shù)。RAPD將其分為兩個(gè)組群，22個(gè)亞組群，PFGE將其分為兩個(gè)組群，28個(gè)亞組群。Johnson等［9］對日本京都一家工廠(chǎng)暴發(fā)的大腸桿菌O157：H7感染調查中，也分別用RAPD和PFGE對從患者糞便中分離的O157：H7進(jìn)行了多態(tài)性分析，并與在東京暴發(fā)流行該病時(shí)分離的菌株進(jìn)行比較，發(fā)現兩者的結果沒(méi)有差異。在以PCR技術(shù)為基礎檢測DNA多態(tài)型的眾多方法中，RAPD是一種快速、簡(jiǎn)單的方法。它為大腸桿菌O157：H7提供了一種高效區分不同亞組群的方法。雖然相對于PFGE其區分能力略遜一籌，但它快速簡(jiǎn)單，不像PFGE需要較長(cháng)時(shí)間，可作為PFGE方法的參照。另外，RAPD對DNA的要求不高，只需少量模板就可用于擴增反應，適用于從食物樣品和糞便中分離的多個(gè)菌株的分析。

　　2.4  隨機片段長(cháng)度多態(tài)性(AFLP) 

　　AFLP技術(shù)由Zobeau 等于1992 年創(chuàng )立。該方法結合了RFL P 和RAPD 技術(shù)的特點(diǎn)，利用兩種或兩種以上的酶切割DNA ，形成不同酶切位點(diǎn)的限制性酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為PCR 擴增的模板。對于PCR的引物，AFLP作了修飾,將引物與酶切片段識別序列結合起來(lái)，其引物從5′→3′依次為核心序列、酶切識別序列、3′端選擇堿基序列。而核心序列與人工接頭互補，從而實(shí)現選擇性擴增。DNA 片段經(jīng)兩種或兩種以上的酶同時(shí)切割，如果遺傳特性發(fā)生改變，則酶切片段數目、長(cháng)短發(fā)生變化，從而實(shí)現多態(tài)性。Iyoda等［10］分析了46株大腸桿菌O157:H7和其他血清型大腸桿菌O26：11、O114：19、O119：N，結果顯示，同一地區暴發(fā)分離的大腸桿菌O157：H7菌株的AFLP條帶結果具有同一性，在亞分類(lèi)時(shí)可將其歸入同一組群。該結果與脈沖凝膠電泳得出的結果一致。Zhao等［11］利用該方法對48株O157:H7進(jìn)行了分析，并在每對引物的一條引物帶上標記熒光素，以便進(jìn)行儀器解讀，稱(chēng)為熒光AFLP(FAFLP)，共獲得37種不同基因組的DNA指紋，PFGE獲得21種，說(shuō)明FAFLP在一定條件下可以提供更詳細的PFGE不能區分的DNA樣品指紋圖。

　　Smith等［12］通過(guò)對71株O157進(jìn)行FAFLP分析表明，FAFLP較目前的分子生物學(xué)分類(lèi)方法在理論上更為先進(jìn)，實(shí)際操作中更易于標準化。與PFGE方法相比，它可得到的大量更為詳盡的數據，擴增片段可精確到±1bp。在相同的消化連接反應中，通過(guò)使用不同的選擇性引物，可提高或降低其鑒別能力。

    AFLP技術(shù)與RAPD技術(shù)一樣,能產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，但RAPD技術(shù)是在高M(jìn)g2+濃度、低復性溫度、短引物序列(10bp)允許引物與模板錯配等不嚴格條件下進(jìn)行擴增，結果易受外界因素的影響，重復性較差［12］。AFLP技術(shù)則不同，引物與模板嚴格配對的堿基數多達17個(gè)，且在56℃退火溫度下進(jìn)行，其結果的可靠性高于RAPD。而RFLP等技術(shù)需要預先制備相應的DNA探針并進(jìn)行雜交，才能得到較低多態(tài)性的結果［13］。AFLP技術(shù)克服了上述兩種方法的缺點(diǎn)，即能獲得較好的多態(tài)性,并且實(shí)驗結果穩定、可靠、重復性好、分辨率高［14］。但AFLP技術(shù)也存在一些不足,如成本高、酶切條件及引物需要篩選、所需時(shí)間略長(cháng)。

　2.5  脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 

　　PFGE的基本原理是通過(guò)電場(chǎng)的不斷改變，使包埋在瓊脂糖凝膠中的DNA分子的泳動(dòng)方向做相應改變，小的DNA分子比大的變化快，故小分子泳動(dòng)得快，從而在凝膠上按染色體大小而呈現出電泳帶型。DNA帶的密度在一定程度上反映了細菌內DNA的含量以及DNA分子的大小，最終達到分型的目的。

    PFGE常用于基因組DNA的分析，是目前分子流行病學(xué)調查最經(jīng)典的方法［15］，已成功用于眾多微生物的遺傳性分析［16］，被世界上許多實(shí)驗室作為菌株基因分型的參考方法，是迄今最常用的亞分類(lèi)方法。目前對病原細菌常用的分子生物學(xué)分型方法有：RFL P，特定片段PCR，RAPD，基因外重復回文序列PCR(Rep-PCR)，裂解酶片段長(cháng)度多態(tài)性(CFLP)，擴增片段長(cháng)度多態(tài)性(AFLP),Multiple-locus variable-number tandem repeats analysis,MLVA)以及Multiple-locus sequence typing,MLST)多位點(diǎn)序列分析等。PFGE與以上方法相比，具有重復性好、分辨率高［17］、結果穩定、易于標準化的優(yōu)點(diǎn)，能在細菌基因組很龐大的情況下，盡可能反映較多的變異信息。但是也存在一定的缺點(diǎn)［18］，比如耗時(shí)；電泳帶型易受人為等多種因素的影響；并不是對所有情況都適合；不能同時(shí)優(yōu)化膠的每個(gè)部分的條帶分布；不能確切地認為相同大小的條帶就是相同的DNA片段；不同條帶之間并不是無(wú)關(guān)的、相互獨立的，而是互相聯(lián)系的；一個(gè)酶切位點(diǎn)的變化可能引起不止一個(gè)條帶的變化；結果不易分析，沒(méi)有國際統一標準，不易于在實(shí)驗室之間進(jìn)行比較，且儀器價(jià)格昂貴。

    PFGE適用于檢測較罕見(jiàn)的限制性?xún)惹忻府a(chǎn)生數量較少，而片段較大的DNA片段，這些片段因分子量較大，常規電泳不能將其分開(kāi)，但可用一個(gè)不斷變化的(脈沖)電場(chǎng)將其分開(kāi)。美國國家公共衛生實(shí)驗室已完成了PFGE標準化流程的制定，并在多次不同的O157:H7暴發(fā)流行中應用。Xu等［19］從113只金龜子中分離到4株大腸桿菌O157:H7，從383份腹瀉患者糞便中分離到10株大腸桿菌O157:H7。對分離到的14株O157:H7進(jìn)行基因組DNA PEGF分析，其中4株從金龜子分離的O157:H7與9株從腹瀉患者分離的O157:H7 PEGF的結果一致，從而證明14株O157:H7具有相同的起源。金龜子可能通過(guò)接觸糞便而攜帶大腸桿菌O157:H7，并在糞便運輸過(guò)程中傳播該菌。Kruger等［20］對分別來(lái)自牛(59株)、羊(4株)和腹瀉患者(33株)的大腸桿菌O157進(jìn)行RAPD-PCR和PFGE分型。RAPD-PCR結果顯示，總共96株菌只是在條帶的亮度上有所差異，具有高度的單形性；PFGE結果則可將96個(gè)菌株分為76個(gè)不同的基因組形式，證明了PFGE在基因分型中的優(yōu)勢。Radu等［7］從食品中分離大腸桿菌O157進(jìn)行的基因分型試驗也證明了PFGE的優(yōu)越性。PFGE已被證明，在大腸桿菌O157:H7的分子流行病學(xué)調查中是一種可靠的分型方法。

　　2.6  多位點(diǎn)可變數銜接重復序列分析(MLVA)
 
　　MLVA多用于哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系的分析，近年來(lái)也被用來(lái)作細菌多態(tài)性檢測，已有多種細菌采用該方法進(jìn)行分型，如炭疽桿菌［21］、耶爾森菌［22］、結核分支桿菌［23］。在真核生物基因組中存在大量的數目可變的銜接重復序列(variable number tandem repeat，VNTR)。VNTR是由幾個(gè)核苷酸(最常見(jiàn)為2～4個(gè))作為核心序列串聯(lián)重復形成的DNA序列，在原核生物基因組中也發(fā)現了這種序列，但它的一般長(cháng)度不到原核生物基因組的1/10。這種序列可存在于原核生物基因中，也可存在于基因之間。大腸桿菌O157：H7中發(fā)現，有7個(gè)VNTR，重復數從6～30個(gè)堿基不等，其中6個(gè)存在于染色體DNA上，另一個(gè)存在于編碼毒力基因的質(zhì)粒上。通過(guò)不同菌株基因組核心序列串聯(lián)重復數的差異，可檢測大腸桿菌O157：H7的多態(tài)性。Lindstedt等［24］用MLVA方法，將69株大腸桿菌O157分為45個(gè)不同型別，用PFGE方法將它們分為44個(gè)，證明ML2VA與PFGE相比具有相同的靈敏度和更高的特異性，具有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，它無(wú)需抽提基因組DNA；其二，該法重復性好，即使不同實(shí)驗者也可得到相同的條帶形式；第三，可制定統一標準，易于各實(shí)驗室間進(jìn)行比較；第四，能在較短時(shí)間內處理大量樣品。運用分子生物學(xué)分型方法檢測大腸桿菌O157：H7的多態(tài)性，為調查其是否潛在暴發(fā)流行提供了有效手段。菌株的分型使得研究食品工業(yè)中O157：H7的污染檢測也更為方便，關(guān)鍵控制點(diǎn)易于找到，使得有適當措施被貫徹來(lái)保證食品的安全。

綜上所述，大腸桿菌O157：H7有多種分子生物學(xué)檢測方法。不同的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，我們應該根據檢測目的和實(shí)驗室擁有的條件選擇最適合的方法進(jìn)行檢測以及其他研究。

作者：黃衍強  右江民族醫學(xué)院微生物學(xué)教研室

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