食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測方法研究進(jìn)展

摘要  單核細胞增生李斯特氏菌是一種重要的食源性致病菌,廣泛分布于自然界。針對目前單核細胞增生李斯特氏菌的檢測現狀,總結了4種現行有效的常用檢測方法,并對各種檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析比較。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù),可精確定量、反應迅速、信號重復性好、靈敏度和特異性高,不需要凝膠電泳過(guò)程,避免了擴增產(chǎn)物對環(huán)境造成的污染問(wèn)題,將是未來(lái)分析檢測發(fā)展的一個(gè)主要趨勢。 
　　關(guān)鍵詞  單核細胞增生李斯特氏菌;傳統檢測方法;酶聯(lián)免疫技術(shù);分子生物學(xué)技術(shù) 

　　單核細胞增生李斯特氏菌(Listeie monocytogenes 簡(jiǎn)稱(chēng)L.M;單增李氏菌)是一種人畜共患病病原菌[1],使人和動(dòng)物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成懷孕婦女流產(chǎn)、死胎等疾病。近年來(lái)國外報道該菌所致的食物中毒越來(lái)越多,病死率高達30%~70%[2-3]。國內也不斷有散發(fā)病例,引起了國內醫學(xué)界的普遍關(guān)注。WHO在20世紀90年代已將其列為食品四大致病菌之一[4-5]。該菌在自然界分布廣泛,以家畜、家禽獸為主要宿主,很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴發(fā)[6-7]。食品是導致人類(lèi)受單核細胞增生李斯特氏菌感染的主要傳播途徑,該菌在4 ℃冰箱保存的食物中仍可生長(cháng)繁殖,是冷藏食品威脅人類(lèi)健康的主要病原菌。在絕大多數食品中都能找到李斯特氏菌,肉類(lèi)、蛋類(lèi)、禽類(lèi)、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特氏菌的感染源[8]。隨著(zhù)我國冷藏、速凍食品消費量的迅速增多,食品中單增李斯特氏菌的潛在危險性也越來(lái)越突出,因此在食品衛生微生物檢驗中,必須加以重視�，F針對其常用檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析比較。 
　　1傳統檢測方法——分離培養 
　　我國于1994年開(kāi)始發(fā)布單核細胞增生李斯特氏菌檢測的國家標準,即GB/T4789.30-1994。目前,很多檢測部門(mén)和單位在進(jìn)行食品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢測時(shí),其主要依據依然是國標法。國標GB/T4789.30-1994自從頒布以來(lái),分別進(jìn)行了3次修訂,分別是GB/T4789.30-2003,GB/T4789.30-2008,直至現在正在實(shí)行中的GB/T4789.30-2010版本。修訂后的GB/T4789.30-2010法,對于樣品檢測依次進(jìn)行增菌、選擇性分離平板分離培養、初篩試驗、鑒定等步驟,通過(guò)增加API鑒定試驗代替生化試驗和協(xié)同溶血試驗。雖然近年來(lái)顯色培養基的應用和ATB生化鑒定儀的聯(lián)合使用已大大簡(jiǎn)化了鑒定步驟,縮短了檢測周期,但由于A(yíng)TB生化鑒定儀鑒定單核細胞增生李斯特氏菌主要依據10種生化反應(主要為糖發(fā)酵),結果的判定主要是依據顏色變化,因此顏色變化不明顯或者不好界定時(shí),其陰陽(yáng)性判定帶有一定的主觀(guān)性。而且使用的API試條和試劑質(zhì)量必須是符合有關(guān)的要求。另外,由于需要二次增菌、平板分離及生化鑒定,整個(gè)過(guò)程至少需要4~5 d�？傊�,傳統單核細胞增生李斯特氏菌分離鑒定方法耗時(shí)長(cháng)、程序繁瑣、試劑和人力成本都比較高。 
　　2免疫學(xué)檢測技術(shù) 
　　由于細菌菌體和鞭毛抗原的存在,使得人們可以建立基于抗原-抗體反應的方法來(lái)檢測食品中的致病菌。目前,從食品中檢測單核細胞增生李斯特氏菌的免疫學(xué)方法主要是ELISA技術(shù),國標GB/T4789.30-2008中也曾將這一方法列為可供選擇的檢測方法之一。其檢測原理主要是將抗原或抗體結合到固相載體表面,再將抗原或抗體特定基團與酶交聯(lián)成酶結合物,當酶結合物同相應的抗原或抗體結合后,則形成酶-抗原抗體復合物;當酶遇到相應的底物時(shí),可以催化產(chǎn)物水解、氧化或還原,從而產(chǎn)生有色物質(zhì)。檢測時(shí)根據有色物質(zhì)的有無(wú)及其深淺,即可間接推斷被檢樣品中有無(wú)相應抗原或抗體存在和數量多少,從而達到定性和定量檢測的目的。Farber等[9]于1987年首先報道了針對單核細胞增生李斯特氏菌鞭毛抗原的單克隆抗體ELISA檢驗程序,應用這一程序,可以在2~3 d內從自然污染的樣品中檢出單核細胞增生李斯特氏菌。在國內方面,范紅結等[10]在1998年研究獲得了3株針對單核細胞增多性李斯特氏菌、無(wú)害李斯特氏菌和格氏李斯特氏菌菌體表面蛋白的單克隆抗體,與其他李斯特氏菌和屬外菌株不發(fā)生反應,為建立LM免疫學(xué)檢測技術(shù)奠定了基礎。單核增多李斯特氏菌的免疫學(xué)方法主要是ELISA技術(shù),具有操作簡(jiǎn)便、通量高的特點(diǎn),可在同一時(shí)間內檢測大量樣品,并可將純肉湯培養物中的分離物進(jìn)行屬水平的鑒定。但由于菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在,還難以進(jìn)行李斯特氏菌種間特異分析。同時(shí),由于單核細胞增生李斯特氏菌表面抗原極其豐富,且大部分優(yōu)勢表位與屬內外細菌有廣泛的交叉抗原,給篩選特異性單克隆抗體帶來(lái)一定的困難,增加了假陽(yáng)性結果的幾率。因此,用ELISA方法從增菌培養物中篩選李斯特氏菌,一般還需要在選擇性分離平板上劃線(xiàn)培養,這同時(shí)也延長(cháng)了檢測周期。 
　　3分子生物學(xué)方法 
　　3.1傳統PCR方法 
　　目前,應用分子生物學(xué)技術(shù)檢測單核細胞增生李斯特氏菌是一個(gè)不斷探討和深化的方向,國外已經(jīng)開(kāi)展了大量的研究工作。聚合酶鏈式反應(Polymerase chain Reaction,PCR)最早由Mulhs和Cetus公司的同事于1985年發(fā)明的,是一種通過(guò)在體外模擬自然DNA復制過(guò)程快速擴增特定DNA序列的方法。隨著(zhù)對單核細胞增生李斯特氏菌研究的不斷深入,人們已經(jīng)積累了大量有關(guān)單核細胞增生李斯特氏菌的資料,許多重要的致病因子如溶血素O、內化素、增溶血因子、磷脂酶、鐵蛋白、熱休克蛋白、過(guò)氧化氫酶及超氧化物歧化酶等已經(jīng)分離提純,其編碼基因序列也已被克隆測序。Bessesen MT等[11]于1990年建立了PCR檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法,通過(guò)擴增李斯特氏菌溶血素基因hlyA中386 bp的PCR方法檢測單核細胞增多性李斯特氏菌,DNA檢測量為25 ng,即1 000個(gè)菌體。姜永強等[12]在應用PCR方法對單增李斯特氏菌進(jìn)行檢定的基礎上,作了如下改進(jìn):用微孔板雜交法檢測單增李斯特氏菌溶血素(Lister-MysinO)編碼基因hlyA片段,使特異性和敏感性大大提高;通過(guò)化學(xué)抽提的方法制備模板,可較好地避免食物成分的抑制。 
　　3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù) 
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)是在傳統PCR檢測技術(shù)的基礎上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù),它通過(guò)在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號的累積實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程,并根據檢測CT值推斷目的基因的初始量。1995年,Bassler HA等[13]最早建立了用于單核細胞增生李斯特氏菌檢測的熒光定量PCR體系,將熒光定量PCR技術(shù)應用于單核細胞增生李斯特氏菌檢測,該體系以hlyA基因為檢測靶點(diǎn),設計合成了相應的檢測探針,檢測靈敏度為50 cfu反應。徐德順等[14]在常規PCR方法檢測單增李斯特氏菌的基礎上,利用特異性探針?lè )ㄗ孕性O計與建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法,對40份食品樣品中單增李斯特氏菌進(jìn)行了檢測,其靈敏度達到了只需19個(gè)細菌就可以得到陽(yáng)性結果,且檢測速度快,包括核酸提取在內整個(gè)檢測時(shí)間僅為3 h左右,比傳統細菌培養法和常規PCR法所需時(shí)間大大縮短,結果更為直觀(guān),靈敏度也更高。
另外,孫烯等[15]又建立了基于SYBRGREEN染料的單核細胞增多性李斯特氏菌的熒光定量PCR檢測方法,并利用此方法檢測人工污染的牛奶中單核細胞增生李斯特氏菌菌量,結果表明檢測靈敏度約為100 cfu反應。劉仲敏等[16]將單增李斯特氏菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測技術(shù)應用于批量樣品的檢測,從加樣到結果只需要2 h左右,不但保留了常規檢測的特異性和敏感性,還可同步完成多達96個(gè)樣品的擴增及定量,適宜于大批樣品的檢測處理,極大地提高了檢測時(shí)限,為食品污染的監測和食物中毒事件的快速反應提供了技術(shù)支持。 
　　4結語(yǔ) 
　　傳統的分離培養鑒定方法,即GB/T4789.30-2010作為各種檢測方法的基礎,目前已經(jīng)和單增李氏菌顯色培養基以及API Listeria生化鑒定試劑盒聯(lián)合使用,較原來(lái)的國家標準方法有了很大程度的改進(jìn),不僅縮短了檢測周期,還大大簡(jiǎn)化了檢測步驟,現已廣泛應用于微生物的檢測,同時(shí)作為其他方法的仲裁標準。但是,在檢測過(guò)程中發(fā)現,API Listeria生化鑒定試劑條主要依據10種生化反應,結果的判定主要依據顏色變化,因此若顏色變化不明顯或者不好界定時(shí),其陰陽(yáng)性判定帶有一定的主觀(guān)性。這是國標方法在檢測過(guò)程中的一個(gè)重要的局限性。免疫法不但經(jīng)濟實(shí)用、重現性好,靈敏度和特異性也較強,特別是近幾年發(fā)展的免疫試劑盒,不僅適用于防疫及衛生技術(shù)檢測監督部門(mén),還可在企業(yè)團體及日常家庭的衛生檢測中使用,是一種非常有希望普及的快速檢測方法。但是免疫法檢測需要開(kāi)發(fā)相應的試劑盒,試劑成本會(huì )相應的提高,對于開(kāi)展工作非常不利。另外,由于菌體及鞭毛抗原交叉反應的存在,還難以進(jìn)行李斯特氏菌種間特異分析。同時(shí),李斯特氏菌屬與其他的細菌間存在共同抗原,給篩選特異性單克隆抗體帶來(lái)一定的困難。因此,用ELISA方法從增菌培養物中篩選李斯特氏菌,一般還需要在選擇性分離平板上劃線(xiàn)培養。 
　　傳統的PCR檢測技術(shù)和常規檢測方法相比,由于特異性引物序列存在,大大增加了檢測的特異性和敏感性,同時(shí)也縮短了檢測時(shí)間,但尚存在著(zhù)諸如同位素標記探針的放射性污染、檢測步驟復雜、耗時(shí)長(cháng)等許多不足,因此使其在實(shí)際檢測工作中的使用受到很大的限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù),利用了PCR技術(shù)核酸擴增的高效性、探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的高敏感性以及計量高準確性等優(yōu)點(diǎn),可精確定量、反應迅速、信號重復性好、靈敏度和特異性高,大大提高了定量的準確性。此外,由于是在封閉的體系中完成整個(gè)擴增和實(shí)時(shí)檢測過(guò)程,不需要凝膠電泳過(guò)程,從而縮短了檢驗時(shí)間,避免了擴增產(chǎn)物對環(huán)境造成的污染問(wèn)題。因此,利用傳統的分離培養結合分子生物學(xué)檢測,將是未來(lái)分析檢測發(fā)展的一個(gè)主要趨勢。 
作者：劉書(shū)花  魏云波  林小靜 李景超《現代農業(yè)科技》
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