金銀花水提物對雙歧桿菌與乳酸桿菌體外生長(cháng)的影響

【摘要】  　　目的探討金銀花水提物對雙歧桿菌、乳酸桿菌體外生長(cháng)的作用。方法制備金銀花水提物濃度為50%，25%，12.5%，6.25%，3.125%，2%，1.0625%的BL肉湯和MRS液體培養基；取兩歧雙歧桿菌Bif1101和保加利亞乳酸桿菌標準株懸液在藥物培養液中生長(cháng)后接種到平板，作平板菌落計數；不同培養時(shí)間點(diǎn)測定稀釋10倍后含不同濃度金銀花水提物的細菌培養液和對照組細菌培養液的吸光度（A）值，計算各培養基吸光度增加值（D A）；測定細菌培養液20，24 h 時(shí)的pH值。結果當金銀花水提物濃度＜6.25％時(shí)，則顯著(zhù)高于對照組；金銀花水提物濃度＞6.25%，則顯著(zhù)低于對照組；乳酸桿菌培養液和雙歧桿菌培養液20，24 h的D A分別在金銀花水提物濃度≤6.25%和≤3.125%時(shí)高于對照組；金銀花水提物濃度＜6.25%時(shí)，則pH值顯著(zhù)低于對照組；而金銀花水提物濃度＞6.25%時(shí)則相反。結論低濃度金銀花水提物可以促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌在體外的生長(cháng)。高濃度金銀花水提物則抑制雙歧桿菌、乳酸桿菌在體外的生長(cháng)。

【關(guān)鍵詞】  金銀花； 雙歧桿菌； 乳酸桿菌； 雙歧因子； 益生菌

　　雙歧桿菌和乳酸桿菌是胃腸道正常微生物區系中的重要有益菌并與宿主終生伴隨，發(fā)揮營(yíng)養、免疫調節、生物屏障、維持腸道菌群平衡等重要作用［1］。臨床上發(fā)現應用雙歧桿菌、乳酸桿菌可以調節機體免疫、輔助治療或預防嚴重感染、多種胃腸道炎癥、過(guò)敏性疾�。�2，3］。而現代藥理學(xué)的研究發(fā)現［4，5］許多中藥和植物含有促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌生長(cháng)的成分�，F代微生態(tài)學(xué)研究表明［6］含有多糖類(lèi)的中藥多具有雙歧因子(bifidus factor, BF)作用，可促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長(cháng)。金銀花性寒味甘，其水溶劑提取物含有葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等多糖類(lèi)物質(zhì)［7］。本實(shí)驗對金銀花水提物在體外對雙歧桿菌、乳酸桿菌生長(cháng)作用進(jìn)行了研究。

　　1  材料

　　1.1  藥物來(lái)源金銀花購自貴州省中藥材公司，經(jīng)重慶醫科大學(xué)藥學(xué)系生藥教研室鑒定為黃褐毛忍冬。取生藥300 g制成300 ml流浸膏，定為100%濃度。

　　1.2  菌種來(lái)源兩歧雙歧桿菌Bif1101 (Bifidobacterium bifium)、保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgraticus)由重慶醫科大學(xué)檢驗系臨床微生物學(xué)教研室提供。

　　1.3  培養基BS培養基、 LBS培養基、 BL肉湯培養基和 MRS液體培養基均自制。

　　2  方法

　　2.1  藥物液體培養基的制備將BL肉湯和MRS液體培養液稀釋為金銀花水提物濃度為50%，25%，12.5%，6.25%，3.125%，2%，1.062 5%的藥物液體培養基。將不同濃度金銀花水提物BL肉湯和MRS培養液的pH值分別調至7.22，6.25，5 ml/管分裝，每一濃度12管。同時(shí)以5 ml/管無(wú)金銀花水提物的BL肉湯和MRS液體培養液各12管（ pH值分別調至7.22，6.25）作為對照組。

　　2.2  菌液的制備兩歧雙歧桿菌Bif1101和保加利亞乳酸桿菌經(jīng)庖肉基復活后，各取一定的純菌液分別接種于5 ml BL 肉湯和5 ml MRS液體培養基中，37℃，48 h厭氧培養后，無(wú)菌生理鹽水水洗3次（2 500 r/min×5 min），用麥氏比濁管調整菌液濃度為6×108個(gè)/ml，經(jīng)純菌檢查證實(shí)為無(wú)污染的純細菌懸液。

　　2.3  指標

　2.3.1  平板菌落計數取含不同濃度金銀花水提物的藥液培養基和對照管，分別加入制備好的雙歧桿菌、乳酸桿菌懸液0.1 ml，厭氧培養24 h。分別從管中取培養液0.1 ml，用大便稀釋液將其依次進(jìn)行10倍稀釋至10-7，每管選取3個(gè)稀釋度，厭氧培養48 h后作平板菌落計數。細菌的活菌數用對數表示為Log10CFU，活菌數= Log10［均菌落數（滴）×50（滴）×稀釋倍數］。

　　2.3.2   吸光度（absorbency, A）雙歧桿菌組和乳酸桿菌組分別在波長(cháng)610，560 nm處測定剛接種好菌液的不同濃度金銀花水提物的藥液培養基和對照組培養基，稀釋10倍后的A值即A0 h。取同樣的雙歧桿菌、乳酸桿菌細菌懸液按0.1 ml/管接種至不同濃度的BL肉湯、MRS液體培養基，厭氧培養20，24 h，測定各管培養液稀釋10倍的A值即A 20 h，A 24 h，求出各培養基在0～20 h，0～24 h的A增加值（D A值），即D A 20 h= A 20 h- A 0h， D A24h= A24h- A0 h。 令E=D A樣品- D A對照，當E﹥0，提示對細菌有增殖作用；若E≤0，提示對細菌無(wú)增殖作用［4］。

　　2.3.3  pH值含不同濃度金銀花水提物的藥液培養基和對照組培養基各12管，分別加入制備好的雙歧桿菌、乳酸桿菌細菌懸液0.1 ml，厭氧培養24 h。于20，24 h時(shí)測定培養液的pH值［8］。

　　2.4  統計學(xué)處理采用SAS 8.1統計分析軟件包。實(shí)驗結果以±s表示，各組樣本間數據方差齊性，采用單因素方差分析。以P<0.05判定有無(wú)顯著(zhù)性差別。

3  結果

　　3.1  雙歧桿菌、乳酸桿菌平板菌落計數金銀花水提物濃度為6.25%，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落計數與對照組無(wú)顯著(zhù)差別；金銀花水提物濃度＞6.25%，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落計數降低；金銀花水提物濃度＜6.25%，雙歧桿菌、乳酸桿菌菌落計數增加。見(jiàn)表1。表1  各組雙歧桿菌、乳酸桿菌的平板菌落計數比較(略)

　　3.2  雙歧桿菌、乳酸桿菌E值當金銀花水提物濃度≤6.25%，乳酸桿菌組E＞0；當金銀花水提物濃度＞6.25%，乳酸桿菌組E＜0。當金銀花水提物濃度≤3.125%，雙歧桿菌組E＞0；當金銀花水提物濃度＞3.125%，雙歧桿菌組E＜0。見(jiàn)圖1～2和表2。表2  各組雙歧桿菌、乳酸桿菌20，24 h 的E值比較（略）

　　3.3 雙歧桿菌、乳酸桿菌pH值金銀花水提物濃度為6.25%，雙歧桿菌、乳酸桿菌培養液20，24 h的pH值與對照組間無(wú)顯著(zhù)差別；金銀花水提物濃度＜6.25%，雙歧桿菌、乳酸桿菌培養液20 ，24 h的pH值顯著(zhù)降低；金銀花水提物濃度＞6.25%，雙歧桿菌、乳酸桿菌20，24 h 的pH值顯著(zhù)增加。見(jiàn)圖3～4和表3。表3  各組雙歧桿菌、乳酸桿菌20，24 h 的pH值比較(略)

　　4  討論

    乳酸桿菌和雙歧桿菌是人體內最多、最常見(jiàn)的生理性細菌，發(fā)揮營(yíng)養、生物屏障、免疫調節和免疫增強、維持腸道微生態(tài)平衡、抗腫瘤和輻射、抗衰老、降低血液膽固醇、減輕肝臟負荷等［1，2，9，10］多種生理效應。雙歧桿菌［11］對營(yíng)養要求較高，以葡萄糖等單糖和一些低聚糖等有機碳源作為碳源和能量，最適宜的氮源是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物如蛋白胨、肽類(lèi)和氨基酸等。雙歧桿菌生長(cháng)需要鐵、磷、硫、鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鋅等礦物元素和一些輔助生長(cháng)因子，如維生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物、雙歧因子等。乳酸桿菌營(yíng)養要求嚴格，除了碳水化合物，還需要多種氨基酸、維生素、肽類(lèi)等。許多研究發(fā)現不少傳統中藥可以作為雙歧因子促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌增殖的作用［5，6］。

    本文結果提示金銀花水提物對雙歧桿菌、乳酸桿菌的作用有非常明顯的濃度效應現象,即當金銀花水提物濃度＞6.25%時(shí)，表現對雙歧桿菌、乳酸桿菌體外生長(cháng)抑制，且抑制作用隨濃度增加有增強的趨勢；當金銀花水提物濃度＜6.25%時(shí)，表現為促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌體外生長(cháng),且其增殖作用隨濃度增加有所增強的趨勢。推測在金銀花水提物濃度＜6.25%時(shí)，金銀花含有葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等多糖類(lèi)物質(zhì)［7］，游離氨基酸和多種微量元素等［12，13］成分可以促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌生長(cháng)。盡管金銀花水提物濃度低，但可溶性糖含量較高。有研究顯示金銀花含量總糖［14］可以達26.87%,其中可溶性糖含量高到23.65%，故低濃度可以促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖。雖然金銀花也含有綠原酸等［14］抑菌成分，但是抑菌成分難以直接溶于水溶液中，如綠原酸在水中的溶解度為4%，故金銀花水提物濃度＜6.25%時(shí)抑菌成分含量較低時(shí)，不能對細菌生長(cháng)起顯著(zhù)的作用。然而金銀花水提物濃度＞6.25%時(shí)，金銀花水提物中的抑菌成分含量足夠使其抑菌成分對雙歧桿菌、乳酸桿菌體外生長(cháng)起主要作用，且抑菌成分含量隨濃度增加而升高,這與金銀花還含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素等［14，15］ 抑菌成分有關(guān)。金銀花中綠原酸的含量［15］ 為4.29～6.07%，是主要的抑菌成分。平板菌落計數法和測定pH值法的結果均提示6.25%濃度金銀花對雙歧桿菌、乳酸桿菌生長(cháng)的增殖和抑制作用均不明顯，這可能由于6.25%濃度金銀花的增殖或抑菌作用相互抵消，其表現出增殖或抑菌作用不顯著(zhù)；然而測定OD值法的結果顯示6.25%濃度金銀花對雙歧桿菌生長(cháng)的有抑制作用，對乳酸桿菌有增殖作用。A值小數點(diǎn)后第3位數的變化完全可能是儀器的輕微變化所致，故6.25%這一濃度實(shí)際也可以認為是一轉折濃度，與其他實(shí)驗結果基本一致。

本研究顯示金銀花水提物對雙歧桿菌、乳酸桿菌有濃度效應，低濃度促進(jìn)增殖，且毒副作用小，將可能在一定程度上解決抗生素帶來(lái)的副作用，并在防病治病、調節免疫、平衡腸道菌群等方面發(fā)揮一定作用。

作者：冉域辰，黎海芪，劉明芳《時(shí)珍國醫國藥》

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