臨床酵母樣真菌快速鑒定及藥敏實(shí)驗方法的研究

 ［摘  要］ 目的：建立一種臨床酵母樣真菌快速鑒定和藥敏試驗方法。方法：采用珠海麗拓公司生產(chǎn)的真菌分離鑒定檢測試劑盒，對臨床感染真菌標本和酵母樣真菌標準菌株進(jìn)行鑒定，并與法國梅里埃真菌鑒定系統進(jìn)行對照。結果：6株酵母樣真菌標準菌株鑒定符合率為100％，115株臨床標本兩種試劑鑒定符合率為92.55％，藥敏結果顯示臨床標本對咪唑類(lèi)抗真菌藥物出現較高的耐藥性，值得臨床重視。結論：本研究所采用方法操作簡(jiǎn)便，特異性較好，便于臨床酵母樣真菌標本的常規鑒定。

    ［關(guān)鍵詞］ 酵母樣真菌；快速鑒定；藥敏試驗

    在臨床上，由于廣泛使用抗生素、免疫抑制藥物及開(kāi)展移植手術(shù)等因素，致使真菌感染越來(lái)越多。而各種抗真菌藥物的濫用，更加劇了真菌感染的復發(fā)和增加了治療的難度。近年來(lái)的研究發(fā)現造成真菌感染的大部分是酵母樣真菌。因此，對臨床上建立快速酵母樣真菌分離培養、鑒定和藥敏試驗顯得尤為重要［1］。目前，臨床真菌分離培養、鑒定和藥敏試驗大多分開(kāi)進(jìn)行，要花較多的時(shí)間和人力物力，影響臨床診斷。為此，筆者對酵母樣真菌的快速分離培養、鑒定和藥敏試驗同時(shí)進(jìn)行的方法學(xué)進(jìn)行了探討研究，報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    1.1.1  真菌標準菌株  共6株分別是：白色念珠菌1株（編號為CMIDC.1c），熱帶念珠菌1株（編號為CMIDC.2a），光滑念珠菌1株（編號為CMIDY.10），克柔念珠菌1株（編號為CMIDY.6c），季爾蒙念珠菌（編號為CMIDC.5b），新生隱球菌（編號為CMIDD.2b），購自中國醫學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所（南京）。

    1.1.2  臨床標本  自2003年2月至2005年2月，在本院門(mén)診和住院病人中采集。

    1.1.3  對照用API－20C鑒定系統  采用法國生物梅里埃產(chǎn)品。

    1.1.4  真菌分離、鑒定檢測試劑盒，購自珠海市麗拓發(fā)展有限公司。

    1.2  方法

    1.2.1  標準菌株制備  在無(wú)菌條件下從真菌標準菌株保存斜面中，用巴氏接種環(huán)接種到改良的沙氏瓊脂平板上，30 ℃培養24 h~48 h,再轉種活化一代備用。

    1.2.2  臨床標本的準備  把標本先接種到改良的沙氏瓊脂培養基中，30 ℃培養24 h~48 h,再轉接活化一代后備用。

    1.2.3  菌型鑒定  從制備好的標準菌株和臨床標本分離平板中，分別挑取1個(gè)~3個(gè)直徑大于1 mm擬似菌落，加入到鑒定培養基中，混勻。分別取150 μl加入到檢測板的A2~A5，B1~B5鑒別微孔中。

1.2.4  藥敏試驗  從混有菌落的鑒定培養基中取100 μl菌懸液，加入到藥敏培養基中,混勻后分別取150 μl加入到檢測板的A6~A12，B6~B12微孔中。

    1.2.5  結果判斷  將檢測板放入濕盒中,于30 ℃培養20 h~24 h,當B1孔出現明顯渾濁時(shí),各微孔加入顯色液1滴（B5孔除外），繼續培養2 h~4 h觀(guān)察結果，結果判讀參照說(shuō)明書(shū)。

    1.2.6  API20C操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    2  結果

    2.1  標準菌株鑒定結果  兩種試劑對6株標準菌株檢測完全一致,見(jiàn)表1。

    表1  酵母樣真菌標準菌株的鑒定結果菌株（略）

    3  討論

該實(shí)驗方法集真菌藥敏和鑒定于一體，較傳統的藥敏和鑒定方法節省時(shí)間在24 h以上，有利于臨床早期判斷，早期治療的原則。本研究發(fā)現在真菌藥敏和鑒定中，標準菌株及臨床標本分離株的活化和接種量對結果有一定的影響。菌株活化以二代左右為宜，以便獲得生長(cháng)力旺盛的純菌落，同時(shí)發(fā)現鑒定實(shí)驗的接種量在104 cfu/ml~105 cfu/ml為宜。藥敏試驗接種量應控制在103 cfu/ml左右，過(guò)高、過(guò)低接種量都不利于結果判斷。在藥敏試驗中發(fā)現臨床感染真菌對咪唑類(lèi)抗生素出現較多的耐藥性［2］，提示與近期臨床上大量使用該類(lèi)抗生素而引起耐藥菌株增加有關(guān)，值得臨床注意。近年來(lái)，真菌感染特別是酵母類(lèi)真菌感染明顯增加。隨著(zhù)抗真菌藥物數量的增多和耐藥真菌的出現，臨床上迫切需要對真菌進(jìn)行鑒定和藥敏實(shí)驗［2］。在國內現有產(chǎn)品中，還沒(méi)有把真菌鑒定和藥敏試驗在一個(gè)檢測板上，同時(shí)進(jìn)行快速檢測試劑盒，本實(shí)驗采用試劑是利用真菌的特殊生化反應和酶反應，用活細胞線(xiàn)粒體酶特征顯色劑，對真菌進(jìn)行快速鑒定和藥敏試驗，改變了過(guò)去通過(guò)觀(guān)察濁度來(lái)判斷結果的方法，顯色反應鮮明，操作簡(jiǎn)便，判斷準確，是一種比較先進(jìn)的技術(shù)方法，值得推廣［4］。

作者：肖晉《實(shí)用醫技雜志》

    參考文獻：

［1］  王文莉，鄭瑋清，李若瑜，等．采用NCCLS M27A方案微量法檢測念珠菌對抗真菌藥物的敏感性［J］.中國檢驗醫學(xué)雜志，2001，24（2）：107108.   
    ［2］  王慧.243株真菌感染菌株的耐藥性分析［J］.山東醫藥,2004，18（20）：5051.   

［3］  劉先寧．眼部常見(jiàn)酵母樣菌的快速鑒別及藥敏實(shí)驗方法的建立［J］.現代檢驗醫學(xué)雜志，2003，18（2）：3435.

［4］  Tellier R, Krajden M, Grlgorie WGA, et al.Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1992, 36(8):16191625.

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