兩種酵母菌藥敏試驗的介紹及比較

【摘要】  目的：建立一種簡(jiǎn)便、實(shí)用的酵母菌藥敏試驗方法。方法：酵母菌紙片擴散法。結果：38株真菌在M44�睵方案平皿和M27�睞方案平皿上對氟康唑的平均抑菌圈直徑分別為31.32 mm和31.26 mm，t=0.16，P=0.874>0.05；38株真菌在M44�睵方案平皿和M27�睞方案平皿上對沃爾康唑的平均抑菌圈直徑分別為33.50 mm和33.24 mm，t=1.15，P=0.257>0.05。結論：M44�睵酵母菌紙片擴散法敏感試驗方案操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗結果穩定、可靠。

【關(guān)鍵詞】  酵母菌藥敏試驗方法 酵母菌紙片擴散法 比較

    隨著(zhù)各種抗真菌藥物的相繼問(wèn)世和耐藥真菌菌株的出現，真菌藥物敏感性試驗已越來(lái)越受到人們的重視，為此美國臨床試驗室標準化委員會(huì )（NCCLS）于2003年介紹了M44�睵酵母菌紙片擴散法敏感試驗方案，制定了氟康唑（floconazole）和沃爾康唑（voriconazole）質(zhì)控株的參考范圍及氟康唑的抑菌圈解釋標準，研究已證實(shí)氟康唑對酵母菌的紙片擴散法敏感試驗有很好的重復性，可方便、準確地檢測酵母菌對氟康唑的敏感性［1～5］。我科同時(shí)用M44�睵方案和M27�睞方案酵母菌紙片擴散法敏感試驗兩種方法對36株臨床常見(jiàn)酵母菌及2株質(zhì)控株進(jìn)行氟康唑和沃爾康唑紙片擴散法敏感試驗進(jìn)行比較。

　　1.1  試驗菌株 

　　36株臨床常見(jiàn)酵母菌來(lái)源于臨床各科送檢的痰液、尿液及陰道拭子等標本，用SDA（沙保弱培養基）分離培養，先經(jīng)科瑪嘉顯色培養基初步鑒定，后經(jīng)API 20C準確鑒定，其中有白色假絲酵母菌19株，熱帶假絲酵母菌5株，光滑假絲酵母菌4株，克柔假絲酵母菌3株，近平滑假絲酵母菌3株，季也蒙假絲酵母菌2株；質(zhì)控菌株：白色假絲酵母菌ATCC90028 1株和近平滑假絲酵母菌ATCC22019 1株均為北京協(xié)和醫院細菌室老師惠贈。

　　1.2  設備 

　　(35±1)℃孵育箱，0.5號麥氏標準比濁管（自配方法：取0.5 ml 0.048 mol/L BaCl2(1.175%W/VBaCl2·2H2O)加入99.5 ml 0.18 mol/ H2SO4溶液中即可獲得0.5號麥氏標準比濁管。

　　1.3  藥敏紙片 

　　氟康唑25 μg/片，沃爾康唑1 μg/片。

　　1.4  M44�睵方案酵母菌藥敏培養基 

　　此培養基是在普通細菌藥敏試驗所用的M�睭瓊脂基礎上，經(jīng)補充2%的葡萄糖和0.5 μg/ml的美藍改良而成。具體制法：500 ml M�睭瓊脂中加入50 ul美藍（Methylene blue）貯存液（0.1 g美藍加入20 ml無(wú)菌蒸餾水即為美藍貯存液）和10 g葡萄糖，調節pH至7.0，121℃，15 min高壓滅菌，出鍋后在56℃水浴數分鐘，在直徑為90 mm的平皿中倒入25 ml，使培養基厚度約為4 mm。

　　1.5  M27�睞方案酵母菌藥敏培養基 

　　RPMI��1640+2%葡萄糖+MOPS+2%Bacto瓊脂。具體制法：將Bacto瓊脂20 g、MOPS 40 g、葡萄糖20 g溶于900 ml蒸餾水中，調節pH至7.0，115℃高壓15 min，出鍋后冷卻到45℃時(shí)加入RPMI��1640一袋，混勻即可傾注平皿，在直徑為90 mm的平皿中倒入25 ml，使培養基厚度約為4 mm。

　　1.6  方法

　　1.6.1  制備濁度為0.5麥氏管濁度的酵母菌懸液 

　　用接種環(huán)挑取數個(gè)酵母菌菌落到2 ml的無(wú)菌生理鹽水中使酵母菌懸液的濁度為0.5麥氏管濁度，使酵母菌的菌量約為（1～5）106個(gè)/ml。

　　1.6.2  接種藥敏平皿 

用上述制備好的酵母菌懸液浸濕無(wú)菌棉簽后，讓棉簽在試管壁上輕輕擠壓，擠掉多余的酵母菌懸液，用棉簽的側面而不是頂端從三個(gè)不同角度密涂平皿，每個(gè)角度相差約60°，最后沿平皿內緣涂沫一周，每株酵母菌接種M44�睵和M27�睞方案酵母菌藥敏培養基各一塊，在涂布細菌的過(guò)程中應避免劃破平皿上的瓊脂，以免影響觀(guān)察實(shí)驗結果。

1.6.3  貼藥敏紙片 

　　把接種好酵母菌懸液的藥敏平皿放入35℃的孵箱放置約10 min（目的是讓瓊脂充分吸收酵母菌懸液，避免此液體稀釋紙片上的藥物，導致紙片上藥物的擴散速度與酵母菌的生長(cháng)速度的不協(xié)調性），取出后，在每塊平皿上貼氟康唑（floconazole）（25 μg/片）和沃爾康唑（voriconazole）（1 μg/片）各一片，使紙片距離平皿邊緣在15 mm以上，兩紙片間距在30 mm以上，輕輕壓實(shí)，切勿讓藥敏紙片脫落。

　　1.6.4  孵育 

　　讓平皿底朝上蓋朝下，35℃孵育18 h～24 h后判讀藥敏試驗結果，如果真24 h生長(cháng)不足，就延長(cháng)到48 h再判讀試驗結果。

　　1.6.5  判讀結果 

　　以80%抑制區判讀為測量邊界，在抑菌圈邊緣或內部<20%的少量菌落可忽略不計，測量抑菌圈直徑要準確到毫米；NCCLS規定的氟康唑和沃爾康唑對標準菌株抑菌圈直徑（mm）的質(zhì)控允許范圍見(jiàn)表1，NCCLS規定的氟康唑紙片擴散法解釋標準和相應的最小抑菌濃度見(jiàn)表2，但是需要特別指出的是:到目前為止，NCCLS還沒(méi)有建立沃爾康唑紙片法的解釋標準。表1  氟康唑和沃爾康唑對不同標準菌株24 h抑菌圈直徑（略）表2  氟康唑紙片擴散法解釋標準和相應的最小抑菌濃度（略）

　　1.7  質(zhì)量控制 

　　試驗時(shí)，以白色假絲酵母菌ATCC90028和近平滑假絲酵母菌ATCC22019為對照同時(shí)進(jìn)行，其24 h抑菌圈直徑（mm）在規定的允許范圍之內。

　　1.8  數據分析 

　　采用John Steeling創(chuàng )建的WHO NET5和SPSS 11.5處理。

    我科的檢測結果見(jiàn)表3。表3  我科檢測的2株質(zhì)控酵母菌及36株臨床酵母菌在兩種平皿上的結果(略)

    2株標準質(zhì)控菌株在M44�睵方案和M27�睞方案的兩種平皿上對氟康唑和沃爾康唑24 h抑菌圈直徑（mm）在質(zhì)控允許的范圍之內。38株真菌在M44�睵方案平皿和M27�睞方案平皿上對氟康唑的平均抑菌圈直徑（mm）分別為31.32 mm和31.26 mm，經(jīng)配對t檢驗，t=0.16，P=0.874>0.05,說(shuō)明氟康唑在M44�睵方案平皿和M27�睞方案平皿上的藥敏試驗結果無(wú)明顯差異；38株真菌在M44�睵方案平皿和M27�睞方案平皿上對沃爾康唑的平均抑菌圈直徑（mm）分別為33.50 mm和33.24 mm，經(jīng)配對t檢驗，t=1.15，P=0.257>0.05,說(shuō)明沃爾康唑在M44�睵方案平皿和M27�睞方案平皿上的藥敏試驗結果無(wú)明顯差異。

    近年來(lái)，真菌病發(fā)病率呈明顯上升趨勢，特別是條件致病性真菌感染更為常見(jiàn)，這與臨床上濫用抗生素、經(jīng)常應用激素及免疫抑制劑、抗癌藥物導致機體免疫功能下降有關(guān)，加之真菌對抗真菌藥物耐藥性日益加重，因而加強對臨床分離出的酵母菌進(jìn)行藥敏試驗已迫在眉睫。目前，真菌藥敏試驗方法不多，主要有NCCLS推薦的M44�睵方案、M27�睞方案和E�瞭est法，三種方法均有很好的穩定性，我科經(jīng)過(guò)實(shí)際對比發(fā)現M44�睵方案和M27�睞方案有很好的一致性；但是M27�睞方案材料不易獲得，而E�瞭est法價(jià)格昂貴，唯獨M44�睵方案是在普通細菌藥敏試驗所用的M�睭瓊脂基礎上，經(jīng)補充2%的葡萄糖和0.5 μg/ml的美藍改良而成，此法材料易得，價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)便，每個(gè)細菌室均可開(kāi)展此項工作，且檢測結果穩定、可靠，是值得基層臨床微生物實(shí)驗室進(jìn)一步推廣的一種較好的方法。

 作者：楊斌 李華 

【參考文獻】
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