肉桂醛抗白假絲酵母菌實(shí)驗研究

【摘要】  目的探討肉桂醛抗白假絲酵母菌的作用。方法應用芽管實(shí)驗、瓊脂擴散法同步觀(guān)察肉桂醛對白假絲酵母菌酵母型及芽管和假菌絲形成的影響，并用微量稀釋法藥敏試驗測定其最低抑菌濃度。結果瓊脂擴散法抑菌圈直徑為25～37 mm，出芽率小于20%，其最低抑菌濃度(MIC)為250～500 μg/ml。結論肉桂醛具有較好的抗白假絲酵母菌作用。 
【關(guān)鍵詞】  抗白假絲酵母菌作用; 肉桂醛; 芽管實(shí)驗; 瓊脂擴散法
中藥肉桂為樟科常綠喬木的樹(shù)皮，為臨床常用的溫里內服藥物[1]。本課題組所作中草藥對常見(jiàn)深部真菌的抑菌實(shí)驗顯示肉桂醇/水提取液對白假絲酵母菌兼有抑殺酵母型及抑制芽管和假菌絲形成的作用。為探討其抗菌作用的主要成分，本實(shí)驗應用肉桂的主要成分肉桂醛，采用芽管實(shí)驗、瓊脂擴散法同步觀(guān)察肉桂醛對白假絲酵母菌酵母型及芽管和假菌絲形成的影響�，F報告如下。
　　1 材料與方法
　　1.1 菌種及藥液配制將白念珠菌沙保氏平板48 h培養物用生理鹽水洗脫，然后用血球計數法調整菌液濃度為1×108/ml。白念珠菌國際標準株(菌號：ATCC 14053)，北大醫院真菌菌種保藏中心 (北京)提供。肉桂醛用最低量的二甲基亞砜溶解，無(wú)菌水稀釋?zhuān)�肉桂醛的最終作用濃度為1 000～2 000 μg/ml及10 000 μg/ml，兩性霉素B為16～0.3 μg/ml。 二甲基亞砜的終濃度低于1% 。
　　1.2 應用瓊脂擴散法觀(guān)察肉桂醛對白假絲酵母菌的抑制作用將白假絲酵母菌沙保氏平板48 h培養物用生理鹽水配成1×109 •ml-1濃度菌液，用無(wú)菌棉簽沾取菌液在沙氏平板上作均勻密集劃線(xiàn)，5 mm孔徑打孔器打孔，加入10.0 mg/ml肉桂醛藥液0.05 ml，37℃溫箱作用48 h，用直尺測量抑菌圈直徑大小，以48 h完全不長(cháng)菌作為測量標準，記錄肉桂醛3孔抑菌圈直徑的平均值(以抑菌圈≥10mm為有效)。
　　1.3 芽管試驗對照管加0.3 ml新鮮家兔血清、0.3 ml生理鹽水、0.05 ml菌液;試驗管加0.3 ml新鮮家兔血清、0.3 ml肉桂醛(10.0 mg/ml)、0.05 ml菌液，各管混勻，置37℃水溫箱作用4 h，用壓滴法在低倍及高倍鏡下觀(guān)察出芽情況及細胞形態(tài)[加入0.05 ml菌液至對照管混勻后，立即在高倍鏡下(400×)隨機觀(guān)察數個(gè)視野,每視野細胞數約為80～120個(gè)，試驗管與對照管的菌液取自同一管]。
　　結果判定： 對照管以高倍10個(gè)視野均可見(jiàn)50%以上細胞出芽，隨機計算10個(gè)視野≥20 μm (顯微測微尺測量)菌絲的數量及均值，以均值>3為標準;試驗管同樣觀(guān)察10個(gè)視野,以無(wú)出芽或出芽細胞數<20%且無(wú)≥20 μm的菌絲為有效。
　　1.4 微量稀釋法測定藥敏試驗96孔細胞培養板紫外線(xiàn)照射30 min后，于每板第1排各孔(12孔)內分別加人培養基180 μl，第11孔為陰性對照，第12孔為陽(yáng)性對照;系列稀釋濃度的待測藥液10 μl依次加人相應藥液于各孔中，陰性對照中加20 μl，加入制備的真菌溶液10 μl(陰性對照孔不加)，使最終菌量為0.5×103～2.5×103 cfu/ml，振蕩5 min使各液充分混勻，35℃溫箱培養(濕盒內保持液量)48 h觀(guān)察。未見(jiàn)菌生長(cháng)的最低濃度為最低抑菌濃度(MIC)。
　　2 結果
　　2.1 瓊脂擴散法實(shí)驗重復3次，發(fā)現肉桂醛具有較好的抗白假絲酵母菌酵母型作用，每次結果都可見(jiàn)抑菌圈≥10 mm。見(jiàn)表1。
　　2.2 芽管試驗實(shí)驗重復3次，發(fā)現肉桂醛具有較好的抑制白假絲酵母菌芽管及菌絲的形成，其出芽率小于20%，且無(wú)長(cháng)度≥20μm的菌絲出現。見(jiàn)表1。
　　2.3 微量稀釋法測定藥敏實(shí)驗經(jīng)藥敏試驗發(fā)現肉桂醛的最低抑菌濃度為250 μg/ml(2次)及500 μg/ml(1次)。見(jiàn)表1。表1 肉桂醛抗白假絲酵母菌實(shí)驗研究結果
　　3 討論
隨著(zhù)廣譜抗生素，皮質(zhì)類(lèi)固醇激素和免疫抑制劑廣泛應用及放射性醫學(xué)不斷發(fā)展，病原菌與宿主之間的關(guān)系在不斷發(fā)生變化，體內環(huán)境平衡紊亂，菌群失調，致使內臟真菌病發(fā)病日益增多。目前治療深部真菌感染的藥物種類(lèi)少，且多具毒性，使深部真菌感染難以控制，故尋找與開(kāi)發(fā)無(wú)毒、高效的抗深部真菌藥物十分必要。

白假絲酵母菌是最常見(jiàn)的條件致病性真菌，在檢出致病性真菌中占首位[2，3]，其既常引起皮膚粘膜的感染，又常致肺、支氣管、腸道等深部組織器官的感染。白假絲酵母菌為酵母型真菌，其具有酵母型及菌絲相兩種形態(tài)，但其只有發(fā)育成菌絲相形成假菌絲時(shí)才致病[4]，體外試驗發(fā)現菌絲長(cháng)度大于20 μm時(shí)常具抗吞噬作用，故假菌絲是其重要致病因素。新近發(fā)現白假絲酵母菌對組織細胞的粘附力也與芽管的形成密切相關(guān)，當其芽管形成后，明顯增加細胞表面的疏水性[5]，疏水的白念珠菌顯示出明顯的粘附力[6～8]。白假絲酵母菌的粘附是其侵襲和定居的先決條件，芽管是其粘附的物質(zhì)基礎，也是形成假菌絲的前提。
　　瓊脂擴散試驗是常用的藥物篩選方法之一，但由于白念珠菌在瓊脂培養基上主要為酵母相，故該法只反映藥物抑制了白念珠菌酵母相的生長(cháng)，而不能反映藥物對白念珠菌菌絲相的影響。為此，本研究將芽管試驗應用于抗真菌藥物的篩選，其依據是白念珠菌在含有血清的培養基可由酵母相發(fā)育為菌絲相，當加入試驗藥物后，可阻止白念珠菌發(fā)育為芽管或假菌絲，從而能反映藥物對白念珠菌致病物質(zhì)的影響，對藥物的篩選有重要意義。
從研究結果可以看出，肉桂醛具既能抑制白假絲酵母菌的酵母相，又能有效抑制其出芽及芽管形成。然而，其最低抑菌濃度較高，如要真正應用于臨床，是否要對其進(jìn)行改構或化學(xué)修飾。
 

作者：朱賢森，黃曉東，黃志勤《時(shí)珍國醫國藥》

【參考文獻】
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