氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

【摘要】  目的 分離得到能高效降解氯氰菊酯的菌株。方法 采用選擇性培養基從農藥廠(chǎng)的污泥中進(jìn)行富集和分離篩選高效菌株，并且用16S rDNA序列分析法和其生理生化特征對其進(jìn)行鑒定。結果 該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)，命名為Klebsiella sp.J��2（登錄號為AY989899），菌株J��2能以氯氰菊酯為唯一碳源進(jìn)行生長(cháng)，降解氯氰菊酯的最適溫度是35 ℃,最佳pH是7.0。結論 菌株J��2是一株能高效降解氯氰菊酯的菌株。

【關(guān)鍵詞】  氯氰菊酯；克雷伯氏菌；生物降解
　　
　　Abstract:Objective To isolate a bacterial strain J��2 capable of degrading cypermethrin from sludge of a pesticide manufacturer.Methods Adopting selective culture to screen and isolate the cypermethrin�瞕egrading strain from the samples and identifying the strain by using the 16S rDNA sequence analysis and its taxonomic characteristics. Results This bacterial strain was identified as Klebsiella sp. named J��2.It could grow with cypermethrin as sole source of carbon .The optimal temperature and pH of cypermethrin degradation by the organism were 35 ℃ and 7.0.Conclusion The bacterial strain J��2 effectively degrade cypermethrin.

　　Key words:cypermethrin；Klebsiella sp. J��2；biodegradation

　　隨著(zhù)20世紀80年代無(wú)機鹽農藥和有機氯農藥的相繼禁用，菊酯類(lèi)農藥已發(fā)展為我國現階段使用最廣泛的農藥之一，由于具有廣譜、內吸、觸殺等高效殺蟲(chóng)特性，因此廣受農業(yè)生產(chǎn)者歡迎。但是，大量使用引起的農藥殘留不僅造成環(huán)境與食品的污染，而且影響農產(chǎn)品的質(zhì)量及人們的身體健康。農藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學(xué)降解和光降解等方式。與其他的降解方式相比，微生物降解具有操作簡(jiǎn)單、降解徹底、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此利用微生物技術(shù)處理農藥殘留，并對受污染的土壤與水體進(jìn)行生物修復是一種行之有效的方法。目前對有機磷和有機氯等農藥的微生物降解的研究比較多，而關(guān)于菊酯類(lèi)農藥的降解研究較少。本文從農藥廠(chǎng)的污泥中采集土壤樣品，篩選分離到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（J��2），并對其進(jìn)行篩選、鑒定及降解性能的初步研究［1��3］。

　　1材料與方法

　　1.1培養基
      
　　富集培養基（1 L）：蛋白胨10 g、NaCl 2.0 g、KH2PO4 1.5 g、葡萄糖1.0 g、dH2O 1 000 mL，pH值7.0；經(jīng)115 ℃，滅菌20 min�；�本培養基（1 L）：NH4Cl 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4 0.2 g，NaCl 0.5 g ，加入氯氰菊酯作為唯一碳源，濃度視需要添加。LB液體培養基（1 L）：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g， NaCl 5 g，pH值7.0（固體加2%的瓊脂粉）。

　　1.2實(shí)驗試劑
   
　　氯氰菊酯（質(zhì)量分數95%）原藥和標準品（質(zhì)量分數99.9 %，色譜純）購自成都化學(xué)試劑公司；Taq DNA聚合酶與各種限制性?xún)惹忻妇�購自大連寶生物；3S DNA Gel Purification kit V3.1 購自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上海博亞合成；pMD18�睺載體試劑盒購自大連寶生物。

　　1.3降解菌株的富集和分離
   
　　將采集的農藥污染土樣配制成15%的懸浮液，以5%的接種量接到含25 mg/L氯氰菊酯的富集培養基中，并加適量玻璃珠，37 ℃、160 r/min振蕩培養。待菌長(cháng)出后，取1 mL菌液接入同樣培養基中37 ℃培養，傳代過(guò)程中氯氰菊酯的濃度逐步增高至300 mg/L,大約2 d傳代1次。將富集的農藥降解菌菌液用無(wú)菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5 、10-6）稀釋?zhuān)�分別取0.2 mL懸液涂布在含有50 mg/L氯氰菊酯的無(wú)機鹽固體培養基上，37 ℃培養；當平板出現菌落時(shí)，將單菌落在無(wú)機鹽農藥平板上劃線(xiàn)分離、純化菌株。將生長(cháng)快、菌落規則、傳代穩定的單菌落斜面保存。將初篩純化的斜面單菌落接入含有50 mg/L氯氰菊酯的無(wú)機鹽液體培養基,37 ℃、160 r/min培養2 d，測定其降解率。

　　1.4菌株的鑒定
   
　　菌株的形態(tài)及生理生化特性參照文獻［4,5］進(jìn)行，并采用bioMerieux Vitek全自動(dòng)微生物分析系統進(jìn)行鑒定，菌株16S rDNA的克隆及序列測定和比較參照文獻［6］，提取J��2的基因組DNA作為模板，進(jìn)行菌株J��2的16S rDNA擴增，PCR引物分別為：引物1：5’�睞GACTTTGATCCTGGCTCAG—3’； 引物2：5’�睠GGCTACCTTGTTACGACTTC��3’； 25 μL的體系為：模板DNA 1 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，上、下游引物各1 μL，10×擴增緩沖液（含Mg2+）2.5μL，Taq酶（5U/μL）0.51μL，ddH2O 18 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s ，52 ℃ 30 s ，72 ℃ 90 s，循環(huán)30次；72 ℃ 延伸8 min。用PCR回收試劑盒回收16S rDNA片段并連接到T載體上，轉化到大腸桿菌DH5α，進(jìn)行藍白斑篩選；挑選白斑菌落進(jìn)行插入片段的酶切驗證；測序由上海博亞公司完成。測序結果在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)blastn軟件與GeneBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析比較。

　　1.5氯氰菊酯含量的測定［7-9］
   
　　采用氣相色譜法，取培養液3 mL，移入10 mL具塞刻度試管，分別加入5 mL的石油醚，劇烈震蕩10 min，靜置2 h，重復2次，取上層有機相加入無(wú)水硫酸鈉吸水，并定容，再用氣相色譜儀（VARIAN CP��3800）檢測。檢測條件：檢測器為FID，柱HP��5（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱溫采用程序升溫，起始溫度150 ℃，以30 ℃/min升溫至250 ℃，保持15 min，載氣為氮氣（體積分數99.999%）,流量為40 mL/min，進(jìn)樣量為0.8 μL,FID檢測器溫度290 ℃，進(jìn)樣口溫度260 ℃，分流比為50。氯氰菊酯的降解率按下式計算：降解率=對照樣品殘留量－處理樣品殘留量 對照樣品殘留量其中，對照為不接降解菌或不加降解酶的同樣反應體系。

　　1.6菌株培養
   
　　從 4 ℃保存的J��2菌株斜面接一環(huán)于LB液體培養基，37 ℃搖床培養10 h左右，以此為種子液（OD600控制在1.5左右，下同）。菌體生長(cháng)量的測定：準確量取10 mL培養菌液于已稱(chēng)重的EP管中,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,用無(wú)菌dH2O洗滌2次,小心去上清,所得的菌體在85 ℃烘烤箱中烘至恒重，電子分析天平稱(chēng)重。

　　2結 果

　　2.1高效降解菌的分離和篩選
   
　　采集樣品3份，經(jīng)富集和馴化，將樣品稀釋后涂布于選擇性培養基平板上進(jìn)行分離，選擇平板上共篩選到7株細菌。將這7株細菌分別接種于含有50 mg/L氯氰菊酯的無(wú)機鹽液體培養基中,37 ℃培養24 h后，測定氯氰菊酯的降解率，其中菌株J��2對氯氰菊酯的降解率最高(94.2%),見(jiàn)表1。

　　表1分離的細菌菌株對氯氰菊酯的降解率　略

　　2.2高效降解菌株的初步鑒定
   
　　該降解菌株屬革蘭陰性菌，兼性厭氧菌，呈球桿狀，單個(gè)或短鏈狀排列，長(cháng)0.9～1.2 μm, 寬2.1～2.5 μm，不形成芽孢，有莢膜。在LB培養基培養12 h的菌落直徑為0.5 mm，呈半球形，半透明，濕潤，表面光滑；能利用檸檬酸鹽和葡萄糖作為唯一碳源，氨作為氮源；發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甲基紅實(shí)驗呈陰性；VP反應顯陽(yáng)性；三糖鐵瓊脂試驗不產(chǎn)生H2S；其他生理生化特性見(jiàn)表2。

2.3菌株16S rDNA的序列分析
   
　　以菌株J��2的基因組DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴增，得到長(cháng)度為1 514 bp的擴增產(chǎn)物（見(jiàn)圖1），測序后在GenBank上登錄，登錄號為AY989899。根據同源性比較，菌株J��2與Genebank中的Klebsiella pneumoniae strain 2 (登錄號為DQ444287.1)和Klebsiella pneumoniae strain mcp11 d(登錄號為EF419182.1)  的同源性為99%。因此根據以上形態(tài)特征和生理生化特性,參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第8版)［10］以及16S rDNA序列同源性比較結果,將菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.),命名為Klebsiella sp.J��2。

　　表2分離株J��2的部分生理生化特性　略

　　圖1菌株J��2的16S rDNA　略

　　2.4氯氰菊酯濃度對菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能的影響
   
　　在無(wú)機鹽培養基中加入氯氰菊酯，使其終濃度分別為50、100、150、200、250、300、350、400 mg/L。按種子培養液2%的接種量接種，每個(gè)處理重復3次,37 ℃下160 r/min培養2 d，取樣10 mL測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結果見(jiàn)圖2。從圖2可知，當氯氰菊酯濃度低于200 mg/L時(shí)，菌株Klebsiella sp.J��2可以對氯氰菊酯進(jìn)行降解；同時(shí)，隨著(zhù)氯氰菊酯濃度的提高，其生長(cháng)也逐步提高，在200 mg/L時(shí)達到最大值；而當氯氰菊酯濃度超過(guò)250 mg/L時(shí)，菌株Klebsiella  sp.J��2細胞由于受到氯氰菊酯毒性的作用，菌體的生長(cháng)受到抑制，因此，菌株的生長(cháng)和對氯氰菊酯的降解隨之下降，到400 mg/L時(shí)基本不能生長(cháng)，降解率也趨于零。

　　圖2氯氰菊酯濃度對菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能的影響　略

　　2.5溫度對菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能的影響
   
　　按種子培養液2 %的接種量接種于內含100 mg/L氯氰菊酯的無(wú)機鹽培養基中,分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下160 r/min培養2 d,每個(gè)處理重復３次，分別取樣10 mL，測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結果見(jiàn)圖3。從圖3可知，在25～45 ℃之間，菌株Klebsiella sp.J��2生長(cháng)和降解氯氰菊酯的效果較好，其中以35 ℃時(shí)最佳，氯氰菊酯降解率達95.21 %；在25 ℃以下及45 ℃以上時(shí)，菌體生長(cháng)較慢，氯氰菊酯降解率有不同程度的下降。

　　圖3溫度對菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能的影響　略

　　2.6 pH對菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能的影響
   
　　測定pH在5.0-10.0之間對菌株降解率的影響。分別配制pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的磷酸氫二鈉��檸檬酸緩沖液和甘氨酸��氫氧化鈉緩沖液，加入NaNO3、KCl滅菌，冷卻后合并，分開(kāi)滅菌的CaCl2、MgSO4·7H2O，使用前加入100 mg/L的氯氰菊酯。按種子培養液2%的接種量接種，每個(gè)處理重復３次,37℃下160 r/min培養2 d后，取樣10 mL測定菌體生物量和氯氰菊酯的降解率，結果見(jiàn)圖4。從圖4可知，在pH 5.5-7.5之間，菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能比較好，最適pH為7.0，降解率為96.11%。
   
　　圖4pH對菌株Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解效能的影響　略

　　2.7菌株Klebsiella sp.J��2的降解底物譜研究
   
　　按種子培養液2%的接種量接種于含100 mg/L不同菊酯類(lèi)農藥和1 %葡萄糖的無(wú)機鹽培養基中,于37 ℃下160 r/min培養2 d后,取樣10 mL測定菌體生物量和不同菊酯類(lèi)農藥的降解率，結果見(jiàn)表3。從表3可知, 菌株Klebsiella sp.J��2對各種菊酯類(lèi)農藥都有比較好的降解能力,特別是對氯氰菊酯、甲氰菊酯的降解作用非常明顯,而對氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯的降解作用則不明顯。

　　表3菌株Klebsiella sp.J��2的降解底物譜研究　略

3結 論
   
　　通過(guò)富集培養從農藥廠(chǎng)的污泥中分離到一株能以氯氰菊酯為唯一碳源生長(cháng)且能將其高效降解的細菌，經(jīng)生理生化試驗及16S rDNA初步鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.),命名為Klebsiella sp.J��2;對降解菌Klebsiella sp.J��2的生長(cháng)和降解條件進(jìn)行了初步的研究，該菌株降解氯氰菊酯的最適溫度是35 ℃,最佳pH是7.0;降解菌Klebsiella sp.J��2還能降解甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯等多種菊酯類(lèi)農藥。
   
　　4討 論
   
　　為了分離特定農藥的降解菌，富集時(shí)以這種農藥為唯一碳源和能源，只添加必要的無(wú)機鹽，在特定生長(cháng)條件下（即在某一選擇壓力下）長(cháng)期培養微生物，在此條件下生長(cháng)并且占優(yōu)勢的微生物一定能夠分解利用此條件中的營(yíng)養物質(zhì)。按照這一原理設計富集培養基，從長(cháng)期受菊酯農藥污染的土壤中采集樣品，以此富集培養基連續富集馴化，在此培養基中生長(cháng)的微生物即能利用氯氰菊酯作為碳源進(jìn)行生長(cháng)，并在培養環(huán)境中占據優(yōu)勢。
   
　　本文初步分析了不同的外界條件對菌株的降解效能的影響。結果表明，菌株對這些條件都有一個(gè)適宜的適應范圍，在此范圍內具有較好的降解力，超出了這個(gè)范圍，菌株的降解效能就受到影響。不同的條件具有不同的效果，這可能是由菌株的生理結構及特性所決定的。因此在降解菌的開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中，應該綜合考慮到這些因素的影響，并合理利用，以充分發(fā)揮菌株的降解效能。

作者：梁衛驅,劉玉煥,李荷《廣東藥學(xué)學(xué)報》

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