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【摘要】 目的對黑水纈草愈傷組織誘導培養基和生長(cháng)的培養條件進(jìn)行研究，構建黑水纈草快速繁殖體系。方法通過(guò)篩選外植體，添加不同種類(lèi)及濃度的生長(cháng)調節劑對黑水纈草進(jìn)行愈傷組織誘導、芽增殖培養及生根培養。結果誘導愈傷組織適宜培養基：MS+0.5 mg/LNAA+5.0 mg/L6BA。芽增殖培養以MS+0.2 mg/LNAA+10.0 mg/L6BA為宜。生根培養以MS+0.1mg/LNAA為佳。結論利用組織培養技術(shù)能夠實(shí)現黑水纈草快速繁殖。
【關(guān)鍵詞】 黑水纈草 組織培養 快速繁殖
AbstractObjectiveTo provide some new evidences for rapid propagation of Valeriana amurensis Smir . ex Kom through studying on medium with callus tissue culture and the condition of growth.MethodsPrimary culture of different explants,culture of cluster buds and their rooting culture were conducted on medium of treatment combinations of adding different hormones. ResultsThe appropriate medium for different culture stages were MS+0.5 mg/LNAA+5.0 mg/L6BA in callus culture induction, MS+0.2 mg/LNAA+10.0 mg/L6BA in differentiation and subculture of cluster buds, MS+0.1 mg/LNAA in rooting culture.ConclusionRapid propagation can be achieved with plant tissue culture in Valeriana amurensis Smir . ex Kom.
Key wordsValeriana amurensis Smir. ex Kom; Tissue culture; Rapid propagation
黑水纈草（Valeriana amurensis Smir . ex Kom）為敗醬科（Valerianaceae）纈草屬（Valeriana Linn.）多年生草本植物。在我國產(chǎn)于東北，集中分布于長(cháng)白山及其余脈地區。入藥部位為根和根莖。黑水纈草中主要含有環(huán)烯醚萜、倍半萜、生物堿和黃酮四大類(lèi)型化學(xué)成分［1］，具有鎮靜、解痙、抗腫瘤活性、抗抑郁活性等作用，尤其是其倍半萜類(lèi)和纈草酯類(lèi)化合物具有很大的利用潛力，有望從中尋找出新型的抗抑郁藥和鎮靜藥［2］。目前纈草提取物及其制劑在國際上十分暢銷(xiāo)，銷(xiāo)售額列植物藥前10名［3］。
我國多利用野生纈草資源，不利于大規模生產(chǎn)。由于近年旅游開(kāi)發(fā)以及自然環(huán)境的破壞和無(wú)節制的采挖，野生狀態(tài)的纈草資源已急速下降。又由于纈草屬植物為多年生草本，自然生長(cháng)十分緩慢，野生資源更趨于枯竭。開(kāi)展黑水纈草的組織培養及快速繁殖的研究，就顯得更為迫切和重要。而關(guān)于纈草屬植物的組織培養研究有少數報道，陳建榮等［4］對誘導纈草愈傷組織作了初步研究。經(jīng)查閱文獻，關(guān)于黑水纈草的組織培養尚未見(jiàn)相關(guān)報道。本研究旨在通過(guò)對黑水纈草組織培養的研究，為建立其快速繁殖體系提供依據。
1 材料與方法
1.1 材料本實(shí)驗所用黑水纈草采自于黑龍江伊春綠潭地區，經(jīng)佳木斯大學(xué)生藥學(xué)教研室
1.2 儀器SA-1600-2JZ多功能超凈操作臺(上海稼豐園藝用品有限公司)；ZPQ-280D智能氣候培養箱(黑龍江東拓儀器制造有限公司);YXQ-LS-75SLL立式壓力蒸氣滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫療設備廠(chǎng));電子天平 FA2004(上海恒平科技有限公司)。
1.3 培養基與培養條件采用MS基本培養基，添加0.8%瓊脂，3%蔗糖及不同濃度的植物生長(cháng)調節劑，調節pH值至5.8 ，
1.4 方法將材料經(jīng)流水沖洗30 min后，置于超凈工作臺上消毒接種。先于70%酒精中漂洗30s，再用0.1%HgCl2消毒8 min，最后用無(wú)菌水沖洗7～8次，將消毒后的莖尖、莖段和葉柄切成長(cháng)約1～1
2 結果
2.1 不同外植體對黑水纈草愈傷組織誘導的影響 為了確定黑水纈草愈傷組織的最佳誘導部位，把莖尖、莖段、葉柄基部、葉柄中部和葉片分別接種于含有MS+0.2 mg/LNAA（萘乙酸）+5.0 mg/L6BA（6芐氨基腺嘌呤）的培養基中。接種20 d后，統計愈傷組織誘導率（見(jiàn)表1）。結果表明，在含有MS+0.2 mg/LNAA+5.0mg/L6BA的MS培養基中，以莖尖和葉柄基部為外植體誘導愈傷組織較適宜，帶節間的莖段誘導叢生芽較適宜。
表1 不同外植體對愈傷組織誘導的影響 （略）
2.2 不同植物生長(cháng)調節劑對黑水纈草愈傷組織誘導和生長(cháng)的影響考察了不同濃度配比的NAA和6-BA對愈傷組織誘導和組織生長(cháng)的影響。見(jiàn)表2。
表2 NAA和6-BA 不同濃度的組合（略）
初次培養有多類(lèi)型的愈傷組織產(chǎn)生，繼代后不同類(lèi)型愈傷組織再生能力表現不同。初次培養產(chǎn)生的愈傷組織，質(zhì)地上有疏松、堅硬，顏色有白色、淡黃色、淡綠色、深綠色。其中C系列培養基長(cháng)勢較理想（見(jiàn)表3）。C4號培養基愈傷組織結構致密,表面光滑,繼代后愈傷組織保持旺盛生長(cháng)，培養25 d后可見(jiàn)白色根形成。C1號培養基繼代后生長(cháng)正常，愈傷組織質(zhì)地適中，長(cháng)期培養未見(jiàn)根分化，這種特征的愈傷組織分生能力較強，可用作細胞培養。
表3 C系列配方對莖尖愈傷組織生長(cháng)的影響（略）
2.3 節間莖段叢生芽的誘導和苗增殖培養采用不同濃度配比的6-BA和NAA對黑水纈草帶節間的莖段進(jìn)行誘導。結果表明，經(jīng)過(guò)30d的培養，部分培養基中節間部位長(cháng)芽。其中，以B5號培養基長(cháng)芽的時(shí)間較短，且生長(cháng)速度較快。莖段在培養起始時(shí)即開(kāi)始膨大,并在基部出現較多綠色小點(diǎn),隨著(zhù)植株的生長(cháng)分化出小芽,幼芽數逐漸增多形成芽叢，將叢生芽切割后轉接到不同濃度配比的6-BA和NAA培養基中，其中仍以B5號培養基芽增殖效果為好。
2.4 生根培養當無(wú)根苗長(cháng)至
3 討論
3.1 外植體對愈傷組織誘導效果的影響 在本實(shí)驗中，黑水纈草莖尖培養后優(yōu)先愈傷，然后葉柄和莖段剪切端愈傷，最后是葉片破損處愈傷化。這表明分裂旺盛的部位易愈傷化，剪切受損的部位易愈傷化。造成這種差異的原因可能是由于旺盛生長(cháng)時(shí)期的材料內源激素的含量較高，再分化比較容易。因此，在進(jìn)行愈傷組織誘導時(shí)，選用適宜的組織部位是十分必要的，應盡量選擇未分化或分化程度較輕的組織作為外植體使用。
3.2 植物生長(cháng)調節劑對黑水纈草愈傷組織誘導的影響一般認為誘導愈傷組織成敗關(guān)鍵在于培養的條件。其中，植物生長(cháng)調節劑是極為重要的因素。本實(shí)驗利用6-BA和NAA以不同的濃度配比來(lái)誘導愈傷組織，可以看出當NAA濃度較高而6-BA濃度相對較低時(shí)外植體形成的愈傷組織相對較理想。由此可見(jiàn)，進(jìn)行愈傷組織誘導時(shí)，應加入適量生長(cháng)素而少加入細胞分裂素。對能形成愈傷組織的幾組培養基進(jìn)行比較發(fā)現，在含有6-BA的培養基中愈傷組織可長(cháng)期繼代，并且不褐化。其原因可能是6-BA可延緩組織衰老，從而減緩或抑制了褐化［5］。
3.3 植物生長(cháng)調節劑對黑水纈草苗增殖及生長(cháng)的影響本實(shí)驗利用6-BA和NAA以不同的濃度配比來(lái)進(jìn)行苗增殖培養，發(fā)現隨6-BA濃度增加苗生長(cháng)速度越快，但6-BA的濃度不宜大于10.0 mg/L。NAA在不定芽的分化過(guò)程中具有重要作用，但濃度不宜大于1.0 mg/L。由此可見(jiàn)，進(jìn)行芽增殖培養時(shí)，應加入適量細胞分裂素，加少量生長(cháng)素。這與張蘭英等在寬葉纈草的報道中結果一致。
3.4 植物生長(cháng)調節劑對黑水纈草根的誘導的影響本實(shí)驗采用4種不同濃度的NAA培養基誘導生根，結果發(fā)現NAA濃度相對低時(shí)生根較容易。這可能是由于生長(cháng)素的濃度對生根有一定影響。其濃度較低時(shí)促進(jìn)生根。同時(shí)也說(shuō)明NAA比較適用于黑水纈草的生根。
綜上所述，本實(shí)驗分別確定了愈傷組織誘導、叢生芽培養和生根培養的最佳培養基配方。采用誘導黑水纈草葉柄及莖產(chǎn)生愈傷組織的方法進(jìn)行試驗,結果在較短期內產(chǎn)生大量叢生芽,然后誘導生根,從而為其快速繁殖提供科學(xué)依據。對于莖和葉柄誘導的愈傷組織中，其有效藥用成分的含量和變化，還有待于進(jìn)一步深入研究。
作者：劉娟 汪洋 《時(shí)珍國醫國藥》
【參考文獻】
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�。�3］ 邵云東，高文遠,劉 丹，等. 植物提取物的質(zhì)量控制［J］.中國中藥雜志，2003,28(10)：899.
�。�4］ 陳建榮,秦玉芝,谷巨華.闊葉纈草葉愈傷組織誘導初步研究［J］.吉首大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000,21(3)：14.
［5］ 楊增海.園藝植物組織培養［M］.北京：農業(yè)出版社,1987：41.
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