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論文關(guān)鍵詞:山藥 組織培養 外植體 褐化 抗氧化劑 培養基質(zhì)
論文摘要:筆者從山藥不同外植體(葉、莖段、零余子)、培養基中添加抗氧化劑和不同培養基質(zhì)3個(gè)方面進(jìn)行試驗研究。結果表明,山藥不同外植體的褐化程度也不一樣,莖段褐化程度最輕;MS培養基中添加150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)能有效抑制外植體的褐化;在山藥組培苗的快繁階段采用液體基質(zhì)培養方式能顯著(zhù)降低褐化程度,提高山藥組培苗成活率。
山藥(Chinese yam)具有較高的藥用價(jià)值及營(yíng)養價(jià)值，主要食用器官為地下塊莖，為大眾化的滋補食品，通過(guò)組織培養技術(shù)不僅可進(jìn)行快速繁殖，而且能使優(yōu)良品種種性得以保存延續[1,2]。但山藥在組織培養過(guò)程中存在著(zhù)嚴重的褐化發(fā)應，經(jīng)常發(fā)現山藥組培苗或外植體枯死及其基部培養基顏色黑褐化，這種褐化現象又稱(chēng)為酚污染，嚴重影響外植體的脫分化和培養物的再分化[3]。因此，為了山藥組織培養工廠(chǎng)化育苗的順利進(jìn)行，筆者就山藥組織培養過(guò)程中的褐化現象及有效控制等方面進(jìn)行了研究探討。
1材料與方法
1.1材料
供試材料為寸金薯葉片、莖段、零余子等常用組培外植體為材料[2]，山藥品種寸金薯來(lái)自福建龍巖大池鎮。
1.2方法
1.2.1不同外植體褐化反應研究觀(guān)察從生長(cháng)植株上取其幼嫩莖節間部莖段、完全伸展的葉片及結出的零余子為外植體，先將外植體用自來(lái)水反復沖洗后，在無(wú)菌條件下，用70%酒精消毒20~30s，再放入2%次氯酸鈉溶液中消毒10~15min，再用無(wú)菌水漂洗3~4次，最后將外植體切成大小適合的小塊接種在已配好的MS培養基中進(jìn)行培養[1,2,4]。葉片大小為0.3~0.5cm方形，莖段（含節間）0.6~0.8cm，零余子切成0.5~0.6cm左右大小的方塊，瓊脂0.7%，PH值為5.8，培養溫度25±2℃，光照強度為2000lx，每天光照時(shí)間16h。共3種處理，每種處理30瓶，每瓶一個(gè)外植體，重復3次，培養30d后觀(guān)察外植體褐化程度。
1.2.2不同外源物質(zhì)(抗氧化劑)對外植體褐化的抑制作用以山藥含節間部的莖段(0.6~0.8cm)為外植體，經(jīng)滅菌處理后，接種在以下3種處理的MS培養基(PH=5.8)中進(jìn)行培養：A：MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，B：MS+80mg/L半胱氨酸[5,6]，C：MS+0.1%活性炭，每處理30瓶，每瓶一個(gè)外植體，重復3次，觀(guān)察外植體的褐化情況。
1.2.3不同培養基質(zhì)對外植體褐化的影響以山藥莖段愈傷組織分化出的組培苗為外植體，分別接種在MS+0.7%瓊脂（固體培養）和未加瓊脂的MS培養基（液體培養）中進(jìn)行快繁培養，每處理30瓶，每瓶一個(gè)外植體，重復3次，觀(guān)察其在快繁過(guò)程中的褐化情況。
2結果與分析
2.1不同外植體的褐化反應
由此次試驗結果可知，利用山藥不同外植體進(jìn)行組織培養時(shí)，其褐化的程度也不同。當外植體為含節間的莖段時(shí)，其褐化程度最輕，當外植體為切成小方塊的零余子時(shí)，褐化現象最嚴重，葉片的褐化程度居中。表1為此次試驗觀(guān)察統計，由表中的原始數據可看出，零余子褐化程度極其嚴重，在試驗觀(guān)察過(guò)程中發(fā)現采用零余子小塊為外植體的培養基均大面積出現黑褐色現象，甚至發(fā)現有外植體枯死�？赡苁且驗楸旧砹阌嘧觾人宇�(lèi)物質(zhì)較多，再加上進(jìn)行接種前切成小塊材料，損傷面較大，損傷面細胞中的酚類(lèi)物質(zhì)，與氧氣聚合發(fā)生氧化反應，形成較多的有毒醌類(lèi)物質(zhì)，擴散到培養基中，從而抑制其它酶的活性，毒害整個(gè)外植體組織[7,8]。
2.2不同外源物質(zhì)對褐化的抑制作用
根據試驗觀(guān)察結果，加入3種外源物質(zhì)在早期均能有效抑制外植體的褐化，但隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)，3種外源物質(zhì)抑制褐化作用開(kāi)始分化，C處理（MS+0.1%活性炭）最早發(fā)現外植體褐化，而且隨著(zhù)培養時(shí)間的再次延長(cháng)，褐化現象越來(lái)越重，外植體基部培養基褐化塊直徑最大達到4cm；MS+80mg/L半胱氨酸組合在褐化抑制作用上較好于C處理，此次試驗表現出最佳抑制效果的是A組合，即：MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，其在培養早期發(fā)現只有2個(gè)樣本有輕微褐化現象，而且隨著(zhù)培養時(shí)間的逐步增加，褐化程度表現也并不十分明顯，僅僅在培養35d左右時(shí)，在外植體基部培養基出現了少量的褐化現象，而且褐化塊的直徑僅為0.8cm左右，各處理褐化抑制作用趨勢見(jiàn)圖1所示，組合B與組合C的發(fā)生褐化平均瓶數在同一培養時(shí)間段均高于組合A，同時(shí)組合A在培養20d至40d時(shí)間段出現褐化樣本數增幅不大，所以圖1組合A的抑制作用趨勢圖也較組合B與組合C平穩，因此組合A對樣本褐化的抑制起到了較好的作用。
2.3不同培養基質(zhì)對外植體褐化的影響
外植體褐化現象在固體基質(zhì)培養與液體基質(zhì)培養兩種方式表現差別十分明顯，根據試驗結果，外植體的褐化程度在加了0.7%瓊脂的固體培養基中表現明顯大于液體培養基，在培養時(shí)間達到15d左右時(shí)，外植體基部的固體培養基均出現較明顯的褐化現象，以外植體基部為中心，培養基褐化平均直徑為1.5cm；培養時(shí)間逐步延長(cháng)至30d，組培苗基部培養基褐化直徑達到了4cm左右，部分組培苗出現輕度枯化現象。液體
培養方式在培養時(shí)間達到30d時(shí)，未發(fā)現組培苗有明顯的褐化現象，外植體生長(cháng)狀況良好，但培養時(shí)間達40d后，有少量外植體出現枯化現象，原因可能是因酚類(lèi)物質(zhì)氧化反應產(chǎn)生的有毒醌類(lèi)物質(zhì)在液體中容易被稀釋?zhuān)诙虝r(shí)間內無(wú)法在液體培養基中形成一個(gè)有效作用濃度點(diǎn)，所以外植體生長(cháng)狀況在一定時(shí)間內正常。外植體褐化率與培養時(shí)間在固體培養與液體培養之間的區別如圖2所示，液體培養的外植體褐化率在30d后僅為3%左右，而固體培養褐化率在此時(shí)間段達到了50%，兩種處理在圖2表現出的走勢有顯著(zhù)區別，液體培養方式比固體培養方式更適宜山藥組培苗的快繁。
3討論
褐化是指植物組織培養過(guò)程中，由于外植體組織被切割和接種快繁時(shí)，損傷切面細胞中酚類(lèi)物質(zhì)（底物）在酚氧化酶的作用下與氧氣聚合而發(fā)生氧化反應，形成有毒的醌類(lèi)物質(zhì)，外植體切面迅速變成棕褐色或暗褐色，并逐步擴散至培養基中，抑制其它酶的活性，導致組織代謝紊亂，生長(cháng)受抑制，最終致使外植體死亡[5,9,10]。組織培養中抑制褐變方法目前已有大量的研究，如選擇適宜的外植體、培養溫度、PH值，培養時(shí)對外植體進(jìn)行多次轉移，在培養基中添加防褐劑（抗氧化劑），如抗壞血酸(Vc)、亞硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等[4,6,11]。但在山藥組織培養中還鮮見(jiàn)相關(guān)抑制外植體褐化報道。研究表明，山藥組織培養中不同外植體褐化程度也不同，山藥植株后期結出的零余子褐化程度最嚴重，而其幼嫩節間部褐化程度最輕。在培養基中添加抗氧化劑均在一定時(shí)間內能有效抑制外植體的褐化，但山藥外植體愈傷組織分化的時(shí)間大約為25d左右[2]，所以，只有MS+150mg/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為最適宜配方。因山藥組培苗快繁周期大約30d左右[2]，而液體基質(zhì)培養方式正好在這一段時(shí)間內能使有毒醌類(lèi)物質(zhì)無(wú)法形成一個(gè)有效作用濃度點(diǎn)，因此，在山藥組培苗的快繁階段采用未加瓊脂的液體培養基能有效預防其褐化，提高成活率。褐化是植物組織培養中較為普遍的現象，要從根本上解決這種褐化問(wèn)題，需對褐化發(fā)生的原因、生理生化、遺傳因素及植物品種等方面進(jìn)行更深入的研究。
作者：蔡建榮 《中國農學(xué)通報》
參考文獻
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