疊鞘石斛莖段組織培養與花芽誘導

【摘要】  　　目的研究疊鞘石斛的快速繁殖及離體開(kāi)花的培養體系。方法選用野生的疊鞘石斛帶側芽的莖段作為外植體，培養在附加不同激素的培養基上。結果MS培養基附加6-BA（1.0 mg·L-1），NAA（0.5 mg·L-1）對側芽的誘導效果最佳。而MS培養基附加6-BA（2.0 mg·L-1），NAA（0.4 mg·L-1）最適合叢生芽的增殖。把無(wú)菌苗培養在附加6-BA（2.0 mg·L-1）的MS培養基中，少數植株被誘導開(kāi)花，誘導率為10.0%。結論用帶腋芽的莖段作為外植體在MS培養基中，附加一定的6-BA和NAA可以誘導叢生芽的產(chǎn)生。

【關(guān)鍵詞】  疊鞘石斛； 組織培養； 花芽誘導

　　Abstract：ObjectiveTo study rapid propagation and in vitro flowering system for Dendrobium denndanum.MethodsStem with lateral buds of wild  denndanum was used as explants and cultured on various culture media with different portions of hormone.ResultsThe best medium for lateral buds induction was the MS with addition of 6-BA (1.0 mg·L-1),NAA (0.5mg/L), while MS with the addition of 6-BA (2.0 mg·L-1),NAA (0.4 mg·L-1) was suitable for the cluster shoots propagation. A few plantlets were induced flowering after cultured on MS medium with addition of 6-BA (2.0 mg·L-1), the frequency of floral bud induction was 10.0%.ConclusionThe cluster shoots can be induced from the segments with lateral buds on the MS basic medium with addition of 6-BA and NAA.

　　Key words：Dendrobium denndanum;   Tissue culture;   Induction of floral buds
   
　　石斛是常用名貴中藥材，屬蘭科（Orchidaceae）石斛屬Ddendrobium�，F已發(fā)現，該屬有很多種類(lèi)具有藥用價(jià)值，其中鐵皮石斛、金釵石斛、霍山石斛等藥用價(jià)值很高，價(jià)格昂貴。石斛中含有多種生物堿、抗癌菲、類(lèi)黃酮等物質(zhì)，具有抗衰老、增強機體免疫力等作用［1］，其應用范圍較廣，需求量不斷增加。但近年來(lái)由于受過(guò)度采伐、生長(cháng)緩慢、繁殖率低等因素的影響，使石斛的野生資源嚴重枯竭，我國已將其列為瀕危藥用植物［2］，為挽救石斛屬的植物物種，擴大藥源，前人已對多種石斛屬的植物進(jìn)行了組織培養快速繁殖的研究［3～6］，但對疊鞘石斛的組織培養目前尚未見(jiàn)報道。本文報道了疊鞘石斛莖段在不同激素配比培養基中出芽、發(fā)育成苗的過(guò)程，同時(shí)初步進(jìn)行了離體開(kāi)花的誘導。

　　1   材料與方法

　　1.1  材料供試材料疊鞘石斛Dendrobium denndanum采于貴州省紫云縣，并經(jīng)貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為疊鞘石斛。標本種植于貴州大學(xué)植物標本地。

　　1.2  材料處理與接種選取生長(cháng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害感染的莖段，將其截成長(cháng)1～1.5 cm的帶芽莖段，用流水沖洗1 h，在超凈工作臺用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%的HgCl溶液消毒12 min，無(wú)菌水沖洗5次。將此莖段接種于芽啟動(dòng)培養基上。每個(gè)配方接種10瓶，每瓶接種5段，22～24℃，光照12 h/d，光強度2 000 lx條件下培養。

　　1.3   培養基

　　1.3.1   芽啟動(dòng)培養基①MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂；②MS+6-BA 1.0mg·L-1+ NAA 1.0 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂；③1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂；④1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂。

　　1.3.2  芽增殖培養基①MS+NAA 0.4 mg·L-1+ 不同濃度6－BA（單位同前） +2%蔗糖+0.8%瓊脂；②MS+NAA 0.4 mg·L-1+ 不同濃度KT（單位同前） +2%蔗糖+0.8%瓊脂； ③MS+NAA 0.4 mg·L-1+ 不同濃度ZT（單位同前）+2%蔗糖+0.8%瓊脂。

　　1.3.3  生根培養基  ①MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1 +2%蔗糖+0.8%瓊脂；② MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1 +2%蔗糖+0.8%瓊脂；③ MS+6-IBA1.5 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂。

　　1.3.4   成花誘導培養基① MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1 +2%蔗糖+0.8%瓊脂；②  MS+ ABA 0.5 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂；③ MS+2－4D 0.1 mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂；④ MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2%蔗糖+0.8%瓊脂；上述培養基pH均為5.8。

　　2   結果

　　2.1  啟動(dòng)培養外植體培養30 d后，莖節部的側芽開(kāi)始萌動(dòng)，與培養基接觸的部位逐漸形成乳白色的瘤狀突起，以后突起逐漸膨大，顏色由白轉綠（見(jiàn)圖1），大約40 d以后芽開(kāi)始伸長(cháng)， 60 d后形成叢生狀小苗。幾種誘導啟動(dòng)培養基均能誘導芽的萌發(fā)(見(jiàn)圖2)，其中以培養基①和③中產(chǎn)生的芽多。培養基① 和③ 所含的激素濃度相同而基本培養基不同，分別是MS培養基和1/2MS培養基，說(shuō)明基本培養基對疊鞘石斛芽的萌發(fā)影響不大，6-BA和NAA的濃度對芽的萌動(dòng)和發(fā)育有一定影響，當6-BA在1.0 mg·L-1，NAA在0.5 mg·L-1時(shí)對芽的萌發(fā)生長(cháng)最有利。此外，選擇靠近莖尖的莖節端，通常容易誘導芽的萌發(fā)，這可能與莖尖主要由具有胚性的分生細胞構成，其分裂能力高于莖段的其它部位。

　　2.2  叢生芽的增殖培養 把無(wú)菌苗從莖上切下轉接到增殖培養基中培養。大約10 d左右，在原來(lái)萌發(fā)的芽周?chē)�開(kāi)始產(chǎn)生不定芽,進(jìn)而形成叢生芽，連續轉接2～3次，可以不斷增加叢生芽的數量。常用的細胞分裂素有KT，ZT，6-BA，將這3種激素及不同濃度配比的增殖培養基對芽的增殖進(jìn)行比較（見(jiàn)表1）。結果表明，6-BA的對叢生芽的增殖效果最明顯，平均芽增殖倍數為7.3倍，其中當濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，形成較多的叢生芽，形成的叢生芽最多、且長(cháng)勢好（見(jiàn)圖3），芽的增殖倍數最高，為9.0倍。從表中看出，6-BA影響芽增殖的3個(gè)實(shí)驗濃度中，芽的增殖倍數與6-BA質(zhì)量濃度成正相關(guān)。KT和ZT對芽的增殖也有一定的作用，但效果較6-BA稍差。相同激素不同質(zhì)量濃度的差異性比較，P值大于0.05，而不同激素組合相同質(zhì)量濃度的顯著(zhù)性分析，P值大于0.05。KT質(zhì)量濃度的不同對芽增殖的影響無(wú)明顯的影響。而ZT的兩個(gè)實(shí)驗濃度對芽的倍增數也無(wú)顯著(zhù)的影響。

圖1  剛萌動(dòng)的腋芽（略）

　　圖2  不同培養基對芽啟動(dòng)的影響（略）

　　表1  不同激素對疊鞘石斛叢生芽分化的影響（略）
 
　　p代表顯著(zhù)性差異檢測（P＜0.05；與相同濃度不同激素組合相比）

　　2.3  生根培養將疊鞘石斛健壯無(wú)菌苗轉入生根培養基，大約15d左右，在芽的另一端產(chǎn)生被白色根被覆蓋的幼根，以后根開(kāi)始生長(cháng)，每株生根2～3條。生根效果（表2），從表中看出幾種培養基都能誘導根的產(chǎn)生，其中以MS+6-BA 2.0 mg·L-1 +NAA 0.4 mg·L-1最好，生根率達91％，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1培養基對生根的誘導率為88％，與MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1培養基的誘導率接近。而MS+6-IBA1.5 mg·L-1+NAA0.4 mg·L-1對根的誘導率相對較低，僅為80％。從生根的時(shí)間看，3種培養基的生根時(shí)間差別不大，為14～16d， 3種配比的培養基促發(fā)新根數量以MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.4 mg·L-1最多，平均為6條，而另外兩種配比的培養基促發(fā)根的數量平均為4條。

　　2.4  花芽的初步誘導將長(cháng)至株高約2cm左右、發(fā)育良好的無(wú)根苗轉入誘導成花的培養基中，4種類(lèi)型的成花誘導培養基分別接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，2個(gè)月后，僅有培養基④中的少部分植株形成花芽并開(kāi)花，其余未見(jiàn)花芽形成，誘導成花的培養基④中，30個(gè)植株僅有3株開(kāi)花，誘導率為10%�；ㄑ可�自頂芽位置，且生于叢生苗中（見(jiàn)圖4）。但花朵未完全開(kāi)放，1周左右即枯萎。由于僅有培養基④中少量的植物誘導開(kāi)花，難以看出培養基類(lèi)型、激素類(lèi)型和配比與成花的相關(guān)性。

　　表2  誘導根的結果（略）

　　圖3  叢生芽（略）               

　　圖4  開(kāi)花植株（略）

3  討論
   
　　組織培養獲得石斛再生植株的途徑有器官發(fā)生型和原球莖發(fā)生型［6］。器官發(fā)生型是通過(guò)外植體組織培養，使預先存在的分生組織形成芽(如腋芽)或不定分生組織(如子葉、莖段、愈傷組織等)形成不定芽，該方法是石斛快速繁殖的主要方法。原球莖發(fā)生途徑是通過(guò)石斛適宜外植體誘導產(chǎn)生胚性愈傷組織并增殖,隨后形成類(lèi)胚組織原球莖進(jìn)而發(fā)育成完整的再生植株。原球莖再生植株的方式技術(shù)上相對較困難，周期長(cháng)，需反復壯苗，而直接用帶腋芽的莖段誘導叢生芽，具有取材方便、操作簡(jiǎn)便、繁殖系數高等優(yōu)點(diǎn)，可以較短時(shí)間內獲得大量無(wú)菌苗。對疊鞘石斛的組織培養，目前尚未見(jiàn)報道。本實(shí)驗結果對疊鞘石斛的離體快繁和野生種質(zhì)資源的保存具有一定的參考價(jià)值。
   
　　此外，作者對疊鞘石斛的離體成花作了初步嘗試。前人對蘭科植物離體條件下的花芽形成已有不少報道［7～9］，蘭科植物可以用原球莖和幼小植株進(jìn)行成花誘導。筆者僅對長(cháng)有莖葉的小植株進(jìn)行誘導。結果表明，單加6-BA對花芽的形成有一定的促進(jìn)作用，這與王遠光等［8］的結果相一致。植物的開(kāi)花與外界因子和內在因素的變化存在復雜的關(guān)系，影響植物成花的主要外界因子如光周期、溫度、水分、營(yíng)養等在很大程度上是通過(guò)影響植物內源激素而起作用。因此，有關(guān)植物離體開(kāi)花的研究還需從生理生化、分子生物學(xué)方面作更深入、仔細的研究。

作者：關(guān)萍，石建明 《時(shí)珍國醫國藥》

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