嗜酸乳桿菌對螺旋形和球形幽門(mén)螺桿菌黏附拮抗作用的研究

【摘要】  目的 研究熱滅活狀態(tài)和活菌狀態(tài)嗜酸乳桿菌對螺旋形和球形幽門(mén)螺桿菌(Hp)的黏附拮抗作用。方法 制備人胃上皮腺癌細胞系（AGS）細胞爬片，將兩種狀態(tài)嗜酸乳桿菌和不同形態(tài)Hp菌分組按不同順序加入，作用2 h，革蘭染色后光鏡觀(guān)察分析Hp黏附指數產(chǎn)生的變化，熒光抗體染色法定性評價(jià)黏附于AGS細胞的Hp密度的改變。 結果 革蘭染色后光鏡觀(guān)察分析：排除實(shí)驗組及競爭實(shí)驗組與對照組比較，黏附指數均有明顯下降（P<0.05）。熒光鏡下可見(jiàn)實(shí)驗組黏附于細胞的Hp密度也明顯降低。 結論嗜酸乳桿菌對不同形態(tài)的Hp均具有黏附拮抗作用。

【關(guān)鍵詞】  乳桿菌,嗜酸;螺桿菌,幽門(mén);上皮細胞;胃腫瘤;細菌黏附;熒光抗體技術(shù)

The Antagonism Effect of Lactobacillus Acidophilus on Adherence of Helical and Coccoid Forms of Helicobacter pylori

　　WU Xiaoqian, SHE Feifei, LI Neng,CHEN Yuexiu

　　Department of Pathogeny Biology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China

    ABSTRACT:  Objective  To investigate the antagonism effect on adherence of the helical and coccoid forms of Hp to the gastric epithelial cell by the inactivated and living Lactobacillus acidophilus.  Methods  The AGS cell�瞫eeded coverslips were prepared, then the two different status of Lactobacillus acidophilus and two different forms of Hp were added in different order. 2 hours later, the bacteria were Garm's stained, and the adherence of Hp to AGS cell were observed by microscope and the adherence index was calculated. At the same time, by using FITC�瞔onjuncted antibody, the density of the adhered two different forms of Hp was evaluated under the fluoscence microscope after treatment with inactivated and living Lactobacillus acidophilus.   Result  Compared with the control group, the adherence indexes of the competition test group and the exclusion test group were much lower（P<0.05）, and the density of the adhered two different forms Hp of test groups were much lower than that of the control group.  Conclusion   Lactobacillus acidophilus had antagonism effect on cell adherence of helical and coccoid forms of Hp.
     幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)存在2種形態(tài)：螺旋野生形和球形變異形。在不利于其生長(cháng)繁殖的環(huán)境中，螺旋形Hp可轉變?yōu)榍蛐�。球�?SPAN lang=EN-US>Hp在細菌的傳播及致病中也起著(zhù)重要作用。筆者擬從細菌感染的第一步，即嗜酸乳桿菌對2種形態(tài)Hp的黏附能力的影響探討將嗜酸乳桿菌同時(shí)作為預防和治療Hp感染常規輔助手段的可行性。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株與培養 

　　嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilus標準株6075源自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。Hp國際標準株NCTC11637為本系保存。

　　1.1.1  嗜酸乳桿菌制備 

　　采用MRS液體培養基在厭氧環(huán)境下37 ℃靜止培養36 h，收集菌液分為活菌和滅活2組，滅活組經(jīng)75 ℃水浴滅活30 min。無(wú)血清無(wú)雙抗的F12高糖培養液重懸。

　　1.1.2  螺旋形Hp制備 

　　用含5%新鮮脫纖維羊血的布氏血平板上（含萬(wàn)古霉素10 μg/mL，多粘菌素B  2.5 IU/mL，TMP  5 μg/mL），37 ℃微氧環(huán)境中培養和傳代。傳代后再培養2 d的螺旋形Hp以PBS洗下，無(wú)血清無(wú)雙抗的F12高糖培養液重懸。

　　1.1.3  球形Hp制備 

　　將Hp傳代后再培養2 d，用布氏肉湯（含10%小牛血清）洗下細菌，制成菌懸液。加入滅滴靈（終濃度8 μg/mL），37 ℃微氧環(huán)境培養，直至Hp全部轉為球形（約60 h）。經(jīng)顯微鏡下觀(guān)察及再培養無(wú)菌生長(cháng)，確定為Hp已完全球變。以無(wú)血清無(wú)雙抗的F12高糖培養液重懸細菌備用。

　　1.2 細胞培養和細胞爬片制備 

　　人胃上皮腺癌細胞系AGS細胞由本系保存，培養液為含10%胎牛血清的F12高糖培養液（含10%胎牛血清，青霉素200 IU/mL，鏈霉素50 μg/mL）。置于體積分數為0.05的CO2培養箱中培養，隔天傳代，實(shí)驗所用細胞均處于對數生長(cháng)期。于6孔板內置蓋玻片，每孔接種1×105 mL-1密度的細胞液2 mL，過(guò)夜培養，制成爬片。

　　1.3 兔抗Hp11637多克隆抗體制備 

　　超聲粉碎菌體后，自家兔耳緣靜脈隔周免疫4次后抽心臟血制備血清。間接ELISA法檢測抗體的效價(jià)：以Hp11637超聲抗原包被96孔酶聯(lián)板，對待測血清進(jìn)行1∶100～1∶51 200倍比稀釋后檢測。Western blot檢測抗體的相對特異性：將嗜酸乳桿菌6075裂解物行SDS�睵AGE電泳，以待測血清做一抗。

　　1.4  不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對螺旋形和球形Hp黏附拮抗研究

　　1.4.1  光鏡觀(guān)察并計算黏附指數

　　1.4.1.1  觀(guān)察分析不同狀態(tài)的嗜酸乳桿菌對AGS細胞的黏附情況 

　　將活菌和熱滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌加入6孔培養板中，在37 ℃、體積分數為0.05的CO2環(huán)境中與AGS細胞作用2 h。每孔菌液2 mL，細菌濃度為5×107 CFU/mL。作用完畢后，取出細胞爬片，PBS洗3次，常規革蘭染色后于油鏡下觀(guān)察并隨機計數50個(gè)細胞上活菌或熱滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌的黏附數量。推算出每個(gè)上皮細胞的黏附指數：

黏附指數=黏附嗜酸乳桿菌數/細胞數

　　1.4.1.2  通過(guò)排除、競爭、替換實(shí)驗觀(guān)察分析不同狀態(tài)的嗜酸乳桿菌對螺旋形和球形Hp黏附能力的影響 

　�。�1）排除實(shí)驗組：將活菌和熱滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌加入6孔培養板中，在37 ℃，體積分數為0.05的CO2環(huán)境中與AGS細胞作用1 h，去除未黏附的嗜酸乳桿菌,然后再分別加入螺旋形Hp、球形Hp懸液，繼續孵育1 h；(2)競爭實(shí)驗組：分別將螺旋形Hp、球形Hp懸液與嗜酸乳桿菌活菌組或滅活組懸液同時(shí)加入6孔培養板中混勻，37 ℃、體積分數為0.05的CO2環(huán)境中與AGS細胞作用2 h；(3)替換實(shí)驗組：將螺旋形Hp、球形Hp懸液加入6孔板中，37 ℃、體積分數為0.05的CO2環(huán)境中與AGS細胞作用1 h后，去除未黏附的螺旋形Hp、球形Hp，再加入活菌和熱滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌懸液，混勻后繼續孵育1 h。(4)對照組：將螺旋形Hp、球形Hp懸液加入6孔板中，37 ℃、體積分數為0.05的CO2環(huán)境中與AGS細胞作用2 h。每孔菌液2 mL，每孔中嗜酸乳桿菌及Hp菌量分別達到108 個(gè)。作用完畢后，取出細胞爬片，PBS洗3次，常規革蘭染色后于油鏡下觀(guān)察并隨機計數50個(gè)細胞上螺旋形Hp、球形Hp的黏附數量。推算出每個(gè)上皮細胞的黏附指數:

    黏附指數=黏附螺旋形Hp或球形Hp數/細胞數

　　1.4.2  熒光抗體染色法定性評價(jià)嗜酸乳桿菌的加入對不同形態(tài) Hp 黏附細胞的密度影響 

　　將制備的細胞爬片分組：螺旋形Hp組、球形Hp組，對照組、如
　　1.4.1.2的排除實(shí)驗組、競爭實(shí)驗組、替換實(shí)驗組。每孔菌液2 mL，除對照孔加2 mL無(wú)血清F12高糖培養液外，其余各組每孔中嗜酸乳桿菌及Hp菌量分別達到108 個(gè)。螺旋形Hp組、球形Hp組及對照組孵育2 h，排除實(shí)驗組、競爭實(shí)驗組及替換實(shí)驗組孵育時(shí)間參照1.4.1.2。各組細胞片經(jīng)PBS洗3次，兔抗11637多克隆抗體37 ℃作用30 min，PBS洗3次，用FITC標記的羊抗兔抗體（購自武漢博士德生物工程有限公司）作用30 min，經(jīng)洗滌封片后于熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。實(shí)驗重復3次。

　　1.5  統計學(xué)處理 

　　黏附指數以x±s表示，采用SPSS 12.0統計軟件分析，比較采用成組t檢驗。

　　2 結果

　　2.1 不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對AGS細胞的黏附情況 

　　革蘭染色后油鏡下觀(guān)察可見(jiàn)：活菌狀態(tài)的嗜酸乳桿菌和滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌均對AGS細胞具有較強的黏附活性�；罹鸂顟B(tài)的嗜酸乳桿菌黏附指數（53.00±13.14）與滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌黏附指數（42.00±11.47）比較，差別無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05）。

　　2.2  不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對螺旋形和球形Hp細胞黏附指數的影響

　　2.2.1  不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對螺旋形Hp黏附AGS細胞的影響 

　　革蘭染色后油鏡下可見(jiàn)：螺旋形Hp對AGS細胞具有很強黏附活性。嗜酸乳桿菌先于Hp（排除實(shí)驗組）或同時(shí)與Hp（競爭實(shí)驗組，圖1A）加入細胞中，則螺旋形Hp對AGS細胞的黏附指數明顯下降（P<0.05）。若嗜酸乳桿菌后于Hp（替換實(shí)驗組）加入細胞中，則螺旋形Hp對AGS細胞的黏附指數無(wú)明顯變化（P>0.05）。同一實(shí)驗組中，加入滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌組與加入活菌組比較，其Hp對AGS細胞的黏附指數均較低，差別無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05，表1）。表1  不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對螺旋形Hp黏附AGS細胞的影響（略）

　　2.2.2  不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對球形Hp黏附AGS細胞的影響 

　　革蘭染色后油鏡下可見(jiàn)：球形Hp雖然黏附能力略有下降，但仍保持較強黏附活性。嗜酸乳桿菌先于Hp（排除實(shí)驗組）或同時(shí)與Hp（競爭實(shí)驗組，圖1B）加入細胞中，則球形Hp對AGS細胞的黏附指數明顯下降（P<0.05）。若嗜酸乳桿菌后于Hp（替換實(shí)驗組）加入細胞中，則球形Hp對AGS細胞的黏附指數無(wú)明顯變化（P>0.05）。同一實(shí)驗組中，加入滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌組與加入活菌組比較，其Hp對AGS細胞的黏附指數均較低，差別無(wú)統計學(xué)意義（P>0.05，表2）。

　　2.3  熒光抗體染色法定性評價(jià)嗜酸乳桿菌的加入對不同形態(tài) Hp 黏附細胞的密度影響 

　　ELISA結果顯示：血清抗體效價(jià)為1∶12 800；Western�瞓lot結果顯示：Hp11637裂解物出現多條條帶，而嗜酸乳桿菌6075裂解物則未出現條帶，無(wú)交叉反應。表明制備的血清抗體可用。熒光顯微鏡下可見(jiàn)，螺旋形及球形Hp均能夠高密度的黏附于AGS細胞上，螺旋形Hp的熒光強度略高于球形Hp。加入不同形態(tài)的嗜酸乳桿菌后，排除實(shí)驗組與競爭實(shí)驗組中螺旋形及球形Hp的黏附密度有明顯降低（圖2）。表 2  不同狀態(tài)嗜酸乳桿菌對球形Hp黏附AGS細胞的影響（略）

　　3 討 論

    作為可在胃內常駐的細菌，確切安全的微生態(tài)制劑之一，嗜酸乳桿菌對Hp抗炎抑制作用國內外已有相關(guān)報道。但其機制至今尚未明確，且研究也局限于螺旋形Hp[1��2]。

    多項研究預示球形Hp在Hp的傳播及致病甚至潛在致癌性中起著(zhù)重要作用。有研究顯示抗生素治療后，球形Hp在胃中的潛伏是消化性疾病復發(fā)的重要原因之一[3]。流行病學(xué)調查顯示飲用水與Hp感染關(guān)系密切，支持Hp經(jīng)水傳播的觀(guān)點(diǎn)[4��5]，而Hp在無(wú)營(yíng)養的水中3～4 d后已全部轉變?yōu)榍蛐尉?SPAN lang=EN-US>[6]。有學(xué)者發(fā)現，胃癌組織中的Hp通常是以球形菌的形式存在，癌變胃組織中球形Hp的檢出率顯著(zhù)高于潰瘍病患者[7]。球形Hp被證實(shí)保存了Hp的毒力和生存活力，在條件適宜時(shí)可轉化為螺旋形。因此在開(kāi)發(fā)預防和根除治療Hp感染的方法時(shí)應同時(shí)考慮到其對抗球形Hp的作用，以預防球形Hp的侵入或清除體內球形Hp。

    黏附是細菌感染的第一步。Hp只有黏附定植于胃上皮細胞表面后，才能對抗胃的蠕動(dòng)及排空而不被清除，并生長(cháng)繁殖和致病。阻斷螺旋形及球形Hp黏附于胃黏膜上皮細胞，無(wú)疑能夠對預防其感染和根除治療起積極作用。本研究從球形和螺旋形Hp兩個(gè)角度入手，研究嗜酸乳桿菌的加入對兩種形態(tài)的Hp黏附胃上皮細胞作用產(chǎn)生的影響。

本研究結果顯示：活的嗜酸乳桿菌和滅活狀態(tài)乳酸菌對AGS細胞的黏附能力并沒(méi)有顯著(zhù)差異。這與劉祥等用嗜酸乳桿菌臨床分離株與SGC��7901胃上皮細胞作用后結果一致[8]。無(wú)論是對螺旋形還是球形Hp，滅活狀態(tài)的嗜酸乳桿菌的黏附抑制作用與活菌狀態(tài)比較均呈現減弱趨勢，提示除了菌體本身的因素外，嗜酸乳桿菌細胞外的代謝產(chǎn)物也可能部分影響Hp的黏附活性。替換實(shí)驗的結果顯示，一旦Hp先于嗜酸乳桿菌與上皮細胞接觸，則嗜酸乳桿菌的黏附抑制作用明顯減弱。提示競爭相同的細胞黏附表位是其抑制黏附的主要機制。本實(shí)驗中嗜酸乳桿菌對球形Hp也具有明顯的黏附抑制作用，預示其能有效阻斷外源或體內抗生素使用后誘發(fā)的球變Hp在胃內的定植。球形Hp仍然保持著(zhù)較強的黏附胃上皮細胞的能力，這與球形Hp保存了Hp的毒力說(shuō)法相符。光鏡下計數的黏附指數和熒光鏡下觀(guān)察可以看出，其對AGS的黏附活性略低于螺旋形，這可能與球形Hp的黏附因子的相對低表達有關(guān)。

作者：吳小茜，佘菲菲，李能，陳月秀

【參考文獻】
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