耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內酰胺酶機制研究

摘　要　目的：探討耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內酰胺酶的機制。方法：對臨床分離的112株流感嗜血桿菌耐藥菌用紙片法作β-內酰胺酶測定，用PCR法檢測產(chǎn)酶流感嗜血桿菌中的β-內酰胺酶基因的存在。結果：紙片法測得產(chǎn)酶菌株32株，產(chǎn)酶率28.6％(32/112)；32株產(chǎn)酶菌中PCR法測β-內酰胺酶基因陽(yáng)性菌株29株，陽(yáng)性率為90.6%(29/32)，其中質(zhì)粒DNA模板組陽(yáng)性為25株，基因組DNA模板組陽(yáng)性為4例。結論：(1)流感嗜血桿菌耐氨芐西林主要由質(zhì)粒介導產(chǎn)生β-內酰胺酶所造成。(2)PCR法是研究流感嗜血桿菌是否攜帶β-內酰胺酶基因及該基因所在位置的簡(jiǎn)便而有效的方法。

　　自1972年第一次發(fā)現流感嗜血桿菌因產(chǎn)β-內酰胺酶而致耐氨芐西林以來(lái)［1］，國外對耐氨芐西林流感嗜血桿菌的耐藥機制以及產(chǎn)β-內酰胺酶的分子基礎研究,呈逐年增加趨勢。1978年Bryan等［2］首次報道了質(zhì)粒介導產(chǎn)生β-內酰胺酶的流感嗜血桿菌。此后，圍繞流感嗜血桿菌中的質(zhì)粒編碼β-內酰胺酶及其與耐氨芐西林的關(guān)系進(jìn)行了許多研究。我國由于流感嗜血桿菌的分離率較低，對此問(wèn)題的研究一直沒(méi)有深入。本文作者在本實(shí)驗室成功提高流感嗜血桿菌分離率的基礎上［3,4］，分離獲得36株耐氨芐西林的流感嗜血桿菌，用紙片法測定它們產(chǎn)β-內酰胺酶的情況后，用PCR方法對產(chǎn)酶菌中β-內酰胺酶基因的存在與否進(jìn)行了檢測，對耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內酰胺酶機制作了初步分析。

　　1　材料和方法

　　1.1　流感嗜血桿菌的分離培養　收集痰或咽拭子標本，于1 h內接種于改良的哥倫比亞巧克力瓊脂平板中，置5% CO2孵箱，37℃孵育18～24 h,對疑似流感嗜血桿菌的菌落分別于血瓊脂和營(yíng)養瓊脂平板上作衛星試驗，僅在血瓊脂平板上衛星試驗陽(yáng)性者為流感嗜血桿菌。用常規的紙片法（K-B法）對每個(gè)菌株作體外藥物敏感試驗，根據美國NCCLS標準判讀藥敏結果。從平板上挑取耐氨芐西林的單菌落接種于含3 ml液體HTM培養液的試管中，于5% CO2孵箱37℃孵育培養過(guò)夜，離心收集菌體用于質(zhì)粒制備等后續實(shí)驗。

　　1.2　紙片法測定β-內酰胺酶　將流感嗜血桿菌培養物經(jīng)超聲裂解后直接涂布于β-內酰胺酶紙片上，在15 min內變紅者為陽(yáng)性。超聲儀為Branson Sonifier 250，β-內酰胺酶紙片購自Oxid公司。

　　1.3　PCR法檢測β-內酰胺酶基因

　　1.3.1　PCR引物　針對β-內酰胺酶結構基因的PCR引物由本校分子遺傳學(xué)開(kāi)放實(shí)驗室用PCGENE軟件PCRPLAN程序設計，上海生工生物工程公司協(xié)助合成。引物序列為：上游引物：5′TGGGTGCACGAGTGGGTTAC3′，下游引物：5′TTATCCGCCTCCATCCAGTC3′。

　　1.3.2　PCR反應條件　用PE2400型DNA擴增儀,50 μl PCR反應體系中含有模板DNA 1 μl、上游下游引物各1 μl（濃度為25 μmol/L），10×緩沖液5 μl，dNTP混合物（10 mmol/L）4 μl，并用ddH2O補足至50 μl（Mg2+的終濃度為1.5 mmol/L），以94℃ 3 min→(94℃ 1 min→55℃ 1 min→72℃ 1 min，循環(huán)30次)→72℃ 7 min→4℃保溫。PCR反應后取10 μl產(chǎn)物點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

　　1.3.3　PCR模板的制備　細菌質(zhì)粒DNA用常規堿裂解法分離、RNase Ⅰ消化、酚/氯仿抽提純化［3］；細菌基因組DNA用菌體凍融法制備：取少量細菌于1.5 ml塑料離心管中，用蒸餾水重懸，加入少量溶菌酶于37℃水浴5 min，放入液氮迅速冰凍5 min，取出后立即放入37℃水箱融化5 min，重復凍融3次，室溫下1×104 r/min離心5 min，吸取上清液到新的離心管，加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇于-20℃沉淀30 min，1.5×104 r/min離心沉淀，用10 μl TE溶解后備用。
　　2　結　果
　　2.1　流感嗜血桿菌的分離　自1997年10月至1998年11月,從我院呼吸內科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子標本，分離鑒定出112株流感嗜血桿菌,其中，藥敏試驗證明為氨芐西林耐藥的36株。
　　2.2　β-內酰胺酶檢測結果　36株耐氨芐西林流感嗜血桿菌中，紙片法測得產(chǎn)酶菌株32株，耐藥菌中產(chǎn)酶率88.9%(32/36)。
　　2.3　PCR法檢測β-內酰胺酶基因結果　用針對β-內酰胺酶基因的上游和下游特異性引物擴增后，陽(yáng)性條帶大小為486 bp，擴增結果與預期值相同。32株產(chǎn)酶菌中PCR陽(yáng)性菌株29株，陽(yáng)性率為90.6%。其中以質(zhì)粒為模板PCR陽(yáng)性菌株25株，占產(chǎn)酶菌的78.1%（25/32)；對7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的菌株，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，結果有4株為陽(yáng)性。
　　3　討　論
　　國外對耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β-內酰胺酶的分子機制研究，主要采用的方法是在大量培養細菌的基礎上，通過(guò)CsCl密度梯度超離心等方法獲取較大量的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行限制性?xún)惹忻该盖蟹治�、瓊脂糖凝膠電泳、質(zhì)粒轉化試驗等，大致分析質(zhì)粒DNA的大小、結構，驗證質(zhì)粒介導的耐氨芐西林表型等，獲得質(zhì)粒介導的產(chǎn)酶及其與耐氨芐西林藥物的關(guān)系等的可靠證據［6］。但是，自然狀態(tài)的流感嗜血桿菌菌株中所攜帶的野生型質(zhì)粒的大小、結構、拷貝數差異非常大，對細菌培養的數量、質(zhì)粒抽提純化的方法提出了很高的要求，其結構的變異也造成電泳、酶切分析等方法難以做到精確分析質(zhì)粒的結構。另外，野生型質(zhì)粒的分子量通常較大，常用的轉化實(shí)驗成功率不高；再加上野生型菌株中所含質(zhì)粒結構復雜，而這些方法都未能直接鑒定質(zhì)粒DNA中是否攜帶有編碼β-內酰胺酶的基因。

　　鑒于上述情況，本實(shí)驗設計了針對β-內酰胺酶基因的特異性引物，對所分離獲得的產(chǎn)β-內酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌中該酶編碼基因的存在情況進(jìn)行了直接的PCR檢測。結果發(fā)現，32株產(chǎn)β-內酰胺酶的流感嗜血桿菌，用可靠的堿變性法獲取的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，陽(yáng)性率達到78.1%，而7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的產(chǎn)酶菌株中，有4株在以染色體DNA樣品為模板進(jìn)行的PCR反應中表現陽(yáng)性。這些結果提示耐氨芐西林的流感嗜血桿菌編碼β-內酰胺酶的基因主要存在于所攜帶的質(zhì)粒DNA上，而有少部分酶基因位于染色體DNA上，這與文獻報道的結論一致。從方法上看，本研究所采用的PCR法直接檢測耐氨芐西林流感嗜血桿菌中β-內酰胺酶基因的方法，特異性高，標本產(chǎn)β-內酰胺酶的核苷酸序列具有高度的特異性；敏感性高，PCR方法可將待測DNA片斷的量擴大百萬(wàn)倍，可以檢測細菌含量極微的標本；既可以測質(zhì)粒模板β-內酰胺酶基因，也可以測染色體模板β-內酰胺酶基因；如果配合PCR產(chǎn)物的序列測定等，還可用于β-內酰胺酶分類(lèi)、基因序列分析、分子流行病學(xué)調查等。但PCR方法有假陽(yáng)性的情況，如β-內酰胺酶基因結構出現變異但未影響PCR引物結合位點(diǎn)時(shí)，可能存在PCR陽(yáng)性但基因并無(wú)活性的情況。從理論上講，能產(chǎn)生β-內酰胺酶的菌株均應有相應的編碼基因存在，但本實(shí)驗中有3株PCR陰性，可能的原因是模板制備過(guò)程以及PCR反應過(guò)程所造成的假陰性所致。雖然國外有用PCR方法檢測流感嗜血桿菌菌株、β-內酰胺酶基因及其分類(lèi)的報道［7］，國內袁藝等［8］曾用PCR法檢測流感嗜血桿菌菌株，但對產(chǎn)β-內酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌，分別以其質(zhì)粒DNA和染色體DNA為模板，用PCR方法測β-內酰胺酶基因，研究其產(chǎn)酶和耐藥機制的，國內外均未見(jiàn)報道。

參考文獻
　　1　Gunn BA, Woodall JB, Jones JF, et al. Ampicillin-resistant haemophilus influenzae［J］. Lancet. 1974,2(7884): 845
　　2　Bryan  LE. Transferable chloramphenicol and ampicillin resistance in a strain of Haemophilus influenzae［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1978,14(1):154
　　3　修清玉，賴(lài)國祥，王桂芳，等. 改良哥倫比亞巧克力培養基分離流感嗜血桿菌［J］. 中華醫學(xué)檢驗雜志， 1998，21(3):161
　　4　方　正，羅文侗，修清玉，等，流感嗜血桿菌下呼吸道感染的實(shí)驗與臨床研究［J］. 中華結核與呼吸雜志, 1999,22(4):208
　　5　薩姆布魯克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T. 金冬雁，黎孟楓 譯. 分子克隆實(shí)驗指南. 第2版［M］. 北京：科學(xué)出版社，1992. 19～24
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　　7　Tenover FC, Huang MB, Rasheed JK, et al. Development of PCR assays to detect ampicillin resistance genes in cerebrospinal fluid ample containing Haemophilus influenzae［J］. J Clin Microbiol, 1994, 32(11): 2729
　　8　袁　藝,盧　競，郭章溉，等. 聚合酶鏈反應技術(shù)檢測流感嗜血桿菌［J］. 中華微生物學(xué)與免疫學(xué)雜志, 1997,17(1):25

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