涂片與培養及PCR/RLB檢測淋病奈瑟菌的比較研究

【摘要】  目的：建立以16S rRNA為靶基因的PCR��反向線(xiàn)點(diǎn)雜交技術(shù)（RLB）檢測淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae, NG），并與涂片法及培養法比較。方法：選擇NG 16S rRNA基因設計一對PCR引物，生物素標記下游引物擴增NG DNA，然后與固定在尼龍膜上的特異性寡核苷核探針雜交。并對115例性病高危人群標本進(jìn)行檢測，然后與涂片法與培養法檢測結果進(jìn)行比較。結果：PCR擴增NG DNA的片段長(cháng)度分別為414 bp。通過(guò)對115例臨床標本的檢測， PCR/RLB的陽(yáng)性率為31.3%,而涂片法和培養法的陽(yáng)性率分別為15.7%和21.7%。 結論：PCR/RLB是一種快速、敏感的檢測方法，對NG感染的實(shí)驗診斷具有十分重要的意義。

【關(guān)鍵詞】  聚合酶鏈反應；核酸雜交；淋病奈瑟氏菌

　　The study of Comparing with Smear, Culture and PCR�瞨everse Line Hybridization Assay for Detecting Neisseria Gonorrhoeae

　    Abstract：Objective To develop 16S rRNA PCR�瞨everse line blot hybridization (RLB) assay for detection of N. gonorrhoeae and compare it with smear and culture methods. Methods The DNA from N. gonorrhoeae was amplified with the one set of primer for the 16S rRNA gene. The reverse primers were labeled with biotin. The products were identified by hybridization with its specific oligonucleotide probes labeled with amidogen in a nylon membrane. Then using PCR�睷LB to detect 115 specimens and compare it with smear and culture methods. Results The length of PCR products was 414 bp. The PCR�睷LB positive rate (31.3%) is higher than smear (15.7%) and culture (21.7%)(P<0.05). Conclusion The results of PCR�睷LB in detecting N. gonorrhoeae also provided excellent results. It plays the very important role in detecting of clinical pathogens.

    Key words：Polymerase chain reaction; Nucleic acid hybridization; Neisseria gonorrhoeae

    淋病是由淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae ，NG）感染引起的一種常見(jiàn)的性傳播疾�。�STD），約占全球STD病例的3/4，在我國亦呈逐步蔓延之勢［1］。流行病學(xué)資料顯示NG感染是加速HIV傳播的危險因素，所以選擇更加特異、敏感的檢測方法對于NG的準確診斷及HIV的防治都具有十分重要的意義［2］。近年來(lái)核酸擴增技術(shù)在NG感染檢測方面得到了廣泛的應用,特別是PCR技術(shù)，相比于傳統的培養法，核酸擴增技術(shù)具有較高的敏感性和易于標本收集轉運。本文利用以16S rRNA基因作為靶基因設計PCR引物,再結合反向線(xiàn)點(diǎn)雜交技術(shù)對115份臨床標本進(jìn)行檢測，并將結果與涂片法和培養法進(jìn)行比較。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  標本來(lái)源 

　　115份性病高危人群標本來(lái)源于深圳市福永醫院門(mén)診患者，每人同時(shí)收集3份標本，1份做涂片，1份做培養，1份做PCR/RLB檢測。

　　1.1.2  主要試試劑與儀器 

　　Biobyne C 尼龍膜由Pall公司生產(chǎn)，鏈親和素過(guò)氧化物酶接合物由Roch 公司生產(chǎn)，Taq酶、dNTP購自MBI公司。 Eppendorf公司PCR擴增儀和Shellab雜交箱。

　　1.2  方法

　　1.2.1  涂片 

　　標本涂片自然干燥后，革蘭染色鏡檢，找到多核白細胞內革蘭陰性雙球菌者為陽(yáng)性。

　　1.2.2  細菌培養 

　　標本同時(shí)接種于血瓊脂平板和選擇性淋病奈瑟菌培養基，置5%~10%燭缸內，在36.5℃恒溫箱內培養24 h~36 h，觀(guān)察結果，根據菌落形態(tài)，過(guò)氧化物酶陽(yáng)性，并且涂片鏡檢為革蘭陰性球菌者為陽(yáng)性。

　　1.2.3  DNA提取 

　　將標本置于含有100 μl PCR裂解液（含10 mm PH 8.0 的Tris ,4.5% Triton X��100,4.5% Tween 20）的Eppendorf管中，99℃煮沸30 min后離心備用。

　　1.2.4  PCR 

　　反義引物5'端為生物素標記，特異性探針5'端用氨基標記（見(jiàn)表1）。PCR反應體系25 μl，含10  buffer 2.5 μl，42.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mol/L MgCl2 1.5 μl, 5U/μlTaq 酶0.2 μl，50 pmol引物各0.2 μl，模板5 μl，補水至25 μl。反應條件：95℃ 5 min后，95℃ 0.5 min、58℃ 0.5 min、72℃ 1 min、35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min。表1  淋病奈瑟氏菌引物和特異性寡核苷核探針序列（略）注：SLA 和SLB為引物， SLP為探針

1.2.5  制膜及探針標記
 
　　制備BiodyneC尼龍膜參見(jiàn)文獻［3］。用0.5 mol/L NaHCO3(pH8.4)稀釋opap和SL80p探針，使探針濃度分別為1.25 pmol、0.625 pmol和0.313 pmol。

　　1.2.6  RLB鑒定 

　　參見(jiàn)文獻［3］簡(jiǎn)述之，將PCR擴增產(chǎn)物取5 μl加入含170 μl 2×SSPE/0.1%SDS溶液的管中，混勻后100℃煮10 min，將EP管置于冰中迅速冷卻。用60℃ 2×SSPE/0.1%SDS液漂洗已標記探針的膜5 min，然后將膜置于Miniblotter上，在Miniblotter槽中分別依次加入150 μl PCR擴增產(chǎn)物和2×SSPE/0.1%SDS混合液。60℃雜交1 h。用60℃ 2×SSPE/0.5%SDS液洗兩次，10 min/次。加入2×SSPE/0.5%SDS和1/5000鏈親和素��過(guò)氧化物酶接合物混合液，42℃孵育1 h，再用42℃ 2×SSPE/0.5%SDS液洗膜兩次，10 min/次。再于室溫入用2×SSPE液洗膜兩次，5 min/次，加ECL覆蓋于膜上，1 min后將膜顯影5 min。

　　2  結果

    115份性病高危人群的臨床標本經(jīng)PCR/RLB檢測其陽(yáng)性率31.3%（36/115），而涂片法與培養法分別為15.7%（18/115）和21.7%（25/115）。其中11份培養法陰性標本經(jīng)PCR/RLB檢測為陽(yáng)性，18份涂片法陰性標本經(jīng)PCR/RLB檢測為陽(yáng)性。不同的標本類(lèi)型對三種方法的檢測影響不盡相同，其中前列腺液、宮頸拭子、尿道拭子和白帶標本利用涂片法其陽(yáng)性檢出率最低，而培養法次之，而生殖道分泌物標本利用三種方法其陽(yáng)性檢出率差異無(wú)顯著(zhù)性。表2  PCR／RLB與涂片法和培養法檢測淋病奈瑟氏菌的比較(略)

　　3  討論

    本文選用了編碼NG大亞基核糖體的16S rRNA基因作為檢測靶基因設計引物和探針。通過(guò)對115份標本檢測表明PCR/RLB陽(yáng)性率最高，為31.3%，明顯高于涂片法（15.7%）和培養法（21.7%），其中涂片法最低，只有15.7%，主要是對宮頸拭子、白帶、前列腺液和尿道拭子標本陽(yáng)性檢出率較低。相比之下， 3種方法檢測生殖道分泌物其陽(yáng)性檢出例數則無(wú)明顯差別。主要原因可能是由于尿道拭子標本和前列腺液中NG含量要少于生殖道分泌物。女性淋菌性尿道炎和宮頸炎不典型，無(wú)特異性，診斷依靠病原體鑒定，陰道內有類(lèi)似淋病奈瑟菌形態(tài)的雜菌，涂片難以鑒別，而培養時(shí)，敏感性也不高。

    由于PCR具有較高的敏感性，在DNA提取、PCR擴增、雜交過(guò)程是均需設立陽(yáng)性和陰性對照，同時(shí)對RLB的雜交條件進(jìn)行了優(yōu)化。在本試驗中我們以氨基標記各特異性寡核苷酸探針5'端，再與尼龍膜上的羧基結合制備成膜芯片，并通過(guò)反向線(xiàn)點(diǎn)雜交使固定在尼龍膜上的探針與含有生物素標記反義引物的5'端的PCR產(chǎn)物雜交，然后通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測NG。與同位素標記探針結合放射性自顯影技術(shù)相比，該技術(shù)克服了放射性污染，且具有檢測信號放大作用，具有較高的敏感度。與硝酸纖維膜作為載體相比較，尼龍膜除具有結合單鏈及雙鏈DNA和RNA的能力強，韌性較強，操作較方便外［4］。更重要的是可對重復用于雜交，一次雜交后，PCR產(chǎn)物可用1%  SDS 80℃變性而被洗脫下來(lái)，從而重復使用，極大地節約了成本和時(shí)間。

本文著(zhù)重對三種檢測NG的方法進(jìn)行比較，相比之下PCR/RLB陽(yáng)性率最高。它不僅可用于一般人群NG感染的初篩實(shí)驗，而且對于女性及慢性患者有較為理想的診斷價(jià)值，值得推廣應用。

作者：何大源，向華國，楊波，黃玉佳 

【參考文獻】
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　�。�2］向華國, 熊禮寬, 涂植光. 淋病奈瑟氏菌感染的實(shí)驗診斷進(jìn)展［J］. 重慶醫學(xué),2006,35(21): 1991��1997.
　�。�3］Zwart G, van Hannea EJ, Kamst�瞯an AM,et al. Rapid screening for freshwater bacterial groups by using reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol,2003,69:5875��5883.　　
　�。�4］盧圣棟.現代分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)［M］.第2版.北京:中國協(xié)和醫科大學(xué)出版社，2004.

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