霍亂弧菌中存在不含霍亂毒素基因的噬菌體CTXΦ基因組

【 摘要 】　目的　近年研究發(fā)現產(chǎn)毒霍亂弧菌的毒素基因ctxAB由其溶原性噬菌體CTXΦ編碼，這種絲狀噬菌體可攜帶ctxAB傳遞給無(wú)毒素基因的霍亂菌株。研究認為ctxAB基因與CTXΦ基因組中的其它基因是嚴格共存的。然而在本實(shí)驗室研究中，于不含ctxAB基因的El Tor型霍亂弧菌（EVC）中發(fā)現部分菌株含有RS基因同源序列，為此對這些菌株作CTXΦ基因組的進(jìn)一步研究。方法　以CTXΦ基因組中的ctxA、ctxB、zot、ace、cep和RS1結構基因制備探針，對ctxAB^-菌株染色體作Southern blot檢測，并用PCR方法檢測CTXΦ的感染受體毒素共調菌毛（Tcp）的tcpA基因。結果　發(fā)現有4株分離自河水的霍亂毒素基因陰性EVC菌株仍含有溶原噬菌體CTXΦ的基因組，為ctxA^-ctxB^-zot⁺ace⁺cep⁺RS⁺菌株，另有一株分離自病人的EVC菌株僅表現為RS⁺。這些菌株均含tcpA基因。結論　ctxAB基因并不一定與CTXΦ其它基因共存于一個(gè)菌株中，發(fā)現了在霍亂弧菌中溶原噬菌體CTXΦ基因組內可以不攜帶毒素基因ctxAB的存在形式。

Genome of bacteriophage CTXΦ without the presence of ctxAB exists in ctxAB^- strains of Vibrio cholerae

　　【 Abstract 】　Objective　To research on the lysogenic bacteriophage CTXΦ genome, for isogenous sequences with RS in the chromosomes were found in some strains of ctxAB^- E1 Tor biotype (EVC) isolates in this lab.Methods The DNA probes of CTXΦ genes, including ctxA, ctxB, zot, ace, cep and RS, were prepared and were used to detect the corresponding genes in the ctxAB^- strains with Southern blot analysis. The major gene of CTXΦ receptor Tcp (toxin-coregulated pilus), tcpA, was detected by polymerase chain reaction analysis.Results CTXΦ genome in the chromosomes were found in 4 isolates of ctxAB^- EVC strains from water，and 1 isolate from a patient only possessed RS sequence. tcpA of all these strains was positive.Conclusions The results suggest that ctxAB may not has a concurrent occurrence with other CTXΦ genes. A novel CTXΦ genome without ctxAB gene presents in the chromosome of V. cholerae.

　　【 Subject words 】　Vibrio cholerae　　Cholera toxin　　CTXΦ genome

　　霍亂毒素（CT）是霍亂弧菌的毒力決定因子之一，在腸道內該毒素的分泌可導致嚴重的腹瀉。CT由A、B亞單位組成，這兩個(gè)亞單位的基因ctxA和ctxB位于染色體上，并緊密相連。近年研究發(fā)現在ctxAB周?chē)�存在�?zhù)多個(gè)有意義的基因結構：其上游依次存在zot^[1]、ace^[2]、cep^[3]和orfU^[4]基因，這幾個(gè)基因組成的片段的兩端各存在一個(gè)或多個(gè)同向重復的RS序列，也由此將兩端RS序列所夾著(zhù)的這個(gè)片段稱(chēng)為核心區(core region) ^[3，5]。RS序列編碼一個(gè)位點(diǎn)特異的重組系統^[3，6]，在體外實(shí)驗中，含RS1序列的重組質(zhì)�？烧�合到含18bp長(cháng)的特異位點(diǎn)(attRS1)的霍亂弧菌染色體上。由于這類(lèi)基因的特殊排列形式以及RS的功能，1996年有研究發(fā)現^〔4〕，這群基因實(shí)際上是霍亂弧菌溶原性的絲狀噬菌體(定名為CTXΦ)的基因組，霍亂毒素基因是由CTXΦ編碼的，并且已誘導出和觀(guān)察到這種噬菌體。CTXΦ以霍亂弧菌毒素共調菌毛(Tcp，其A亞單位基因為tcpA)為受體，染色體上的attRS1序列為特異整合位點(diǎn)，因此會(huì )造成毒素基因在致病的和不含ctxAB的非致病菌株間的水平傳播。

　　對于ctxAB、zot、ace、cep和RS等基因在霍亂弧菌菌株染色體上的共存情況，可從一個(gè)方面反映其相互關(guān)系。有些研究認為，若ctxAB基因不存在于菌株中，那么zot基因也不存在^[7，8]，提出ctx與zot和ace是嚴格共存的。但也發(fā)現在一些ctxAB陰性菌株中存在zot基因的情況^[9]。我們從14株國內分離的不含ctxAB基因的El Tor型霍亂弧菌（EVC）流行菌株（ctxAB^-菌株）中，發(fā)現有4株雖不含ctxAB基因，但具有zot、ace、cep和RS基因，另有一株僅含RS基因，這些結果顯示CTXΦ基因組的一種不含霍亂毒素基因的新的存在形式，這對CTXΦ的來(lái)源、ctxAB的攜帶與轉移等方面的深入研究將提出新的論據。

材料與方法

　　1.菌株： EVC CT基因天然缺失的流行菌株均為國內分離，為本室保存及檢測，其來(lái)源及噬菌體-生物分型見(jiàn)表1。古典型霍亂弧菌（CVC）395標準株為對照菌，El Tor型86123株為EVC菌陽(yáng)性對照，均已知含有ctxAB和CTXΦ的所有基因。

表1　實(shí)驗用EVC ctxAB陰性菌株及其ctxA、ctxB和CTXΦ基因的檢測

　　2.探針片段及標記： 檢測ctxA、ctxB、ace及cep基因所用探針片段均為PCR擴增產(chǎn)物，根據已發(fā)表序列設計引物，于本室ABI 391 DNA合成儀上合成。各擴增片段均位于其結構基因內，產(chǎn)物均經(jīng)1.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳純化。ctxA和ctxB的擴增各按常規。擴增ace基因的上游引物為5��-TGC TTA TGA TGG ACA CCC-3��，下游引物為5��-ACG GGT CAT CAA AGC CTG-3��，模板用質(zhì)粒pCVD371（含ace基因，美國馬里蘭大學(xué)菌苗發(fā)展中心JB Kaper教授惠贈），產(chǎn)物長(cháng)263bp。擴增cep的上游引物為5��-GGA ATT CTT CAT GTT TAG CTC ACT G-3��，下游引物為5��-CTG GAT CCC TAT TTA GCC TTA CGA AT-3��，產(chǎn)物長(cháng)267bp。

　　檢測zot基因所用探針為重組質(zhì)粒pBB241（JB Kaper教授惠贈）DNA經(jīng)MluⅠ和Dra Ⅲ雙酶切，1.0%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收850bp片段。此片段為zot結構基因中段。 RS基因檢測探針為重組質(zhì)粒pCT5A11（衛生部蘭州生物制品研究所王秉瑞教授惠贈） DNA經(jīng)BglⅡ酶切，取2.7kb片段，為RS的全部基因。以上各基因片段用地高辛（Dig）非放射性探針標記試劑盒（Boehringer Mannheim 公司產(chǎn)品）以隨機引物法進(jìn)行標記。 tcpA基因的擴增按文獻〔11〕，產(chǎn)物長(cháng)694bp，對該基因用PCR方法電泳鑒定產(chǎn)物。

　　3. 菌株染色體的Southern blot檢測：酚、氯仿法提取各株菌的染色體，經(jīng)HindⅢ完全酶切，0.7％瓊脂糖電泳后，凝膠變性、轉移片段至0.45μm硝酸纖維素膜（北京化工學(xué)校附屬工廠(chǎng)產(chǎn)品），干烤固定DNA，以Dig標記探針檢測試劑盒（Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品）、用所制備的各基因探針進(jìn)行雜交和顯色。

結果

　　對實(shí)驗菌株的ctxA及ctxB基因檢測，結果CVC 395和EVC 86123菌株為陽(yáng)性，其余菌株均為陰性（見(jiàn)圖1及表1）。另外，經(jīng)HindⅢ酶切染色體，395的雜交帶為2條，而86123僅出現1條，均在酶切的大片段上。zot基因探針檢測發(fā)現菌株395、86123、75164、86015、86016和75200為陽(yáng)性，僅395表現為2條雜交帶。ace和cep探針的檢測結果與zot基因檢測結果完全相同（圖1和圖2）。tcpA擴增發(fā)現所有菌株均為陽(yáng)性（圖3）。

　　　　RS探針的雜交表現為395,86123,75164,86015,86016,75200和77013菌株呈陽(yáng)性，395出現2條雜交帶而其余菌株均為1條。以前本室研究發(fā)現菌株77013僅含RS序列^[10]。在RS的序列中有一BglⅡ酶切位點(diǎn)，位于其序列5�付思s1/5處^{〔3，5〕}，在用BglⅡ完全酶切染色體后，經(jīng)RS探針雜交發(fā)現菌株75164，86015，86016和75200均出現2條明顯雜交帶（大約5～6kb片段上），并在約10kb片段處均有一顯色微弱的雜交帶，可能是由BglⅡ酶切后與RS外側染色體相連的RS序列5�競�1/5短片段雜交形成。菌株77013出現了特殊的帶型，為3條，且所在片段均不同于其它菌株（見(jiàn)圖4）。目前經(jīng)檢測發(fā)現77013僅RS探針雜交呈陽(yáng)性。

　　通過(guò)以上檢測，在所研究的EVC菌株中,75164，86015，86016和75200株為ctxA^－ctxB^－zot⁺ace⁺cep⁺RS⁺菌，而77013為ctxA^－ctxB^－zot⁺ace^－cep^－RS⁺菌株，因此前4株為含CTXΦ各基因而沒(méi)有ctxAB基因的菌株。經(jīng)BamHⅠ、Sal Ⅰ等內切酶切染色體以及其與Hind Ⅲ組合進(jìn)行的雙酶切后的雜交結果（未列出），發(fā)現菌株75164，86015，86016和75200的zot、ace、cep和RS序列所在的染色體酶切片段是一致的，且4個(gè)菌株間也相同。

討論

　　質(zhì)粒、噬菌體和轉座子等是細菌中常見(jiàn)的可移動(dòng)的基因成分，目前已知有多種細菌的毒力因子（如毒素基因、侵襲性基因等）是由這些可移動(dòng)的成分攜帶的，例如白喉棒狀桿菌的白喉毒素、葡萄球菌腸毒素A、釀膿鏈球菌的致熱外毒素C等的基因由噬菌體所攜帶，大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素基因、志賀氏痢疾桿菌編碼侵襲力的基因在質(zhì)粒上等等。由于這些成分在菌株間的移動(dòng)，就有可能使不含毒力基因的菌株獲得產(chǎn)毒能力而成為致病菌。比如有研究發(fā)現大腸埃希氏菌不耐熱腸毒素（LT）基因的G+C％比值和遺傳密碼子的利用與大腸埃希氏菌和霍亂弧菌染色體有很大差別，認為LT基因是大腸埃希氏菌獲得的外源性基因，而使之成為致病菌^[11]，而同樣CT基因的G+C%比值(36.8%)與霍亂弧菌染色體的G+C%比值(45%～49%)差別也很大。由于產(chǎn)CT的霍亂弧菌毒素核心區基因及其兩側結構的特殊性，Waldor和Mekalanos^[4]誘導出和證明了攜帶ctxAB的溶原噬菌體CTXΦ。這種噬菌體以霍亂弧菌的Tcp菌毛為受體，如果染色體上同時(shí)存在18bp長(cháng)的attRS序列，則噬菌體DNA可整合到霍亂弧菌染色體上，從而使不產(chǎn)毒素的霍亂弧菌成為產(chǎn)毒株。RS序列負責完成CTXΦ的調控、復制和整合功能^[6]。早先研究Zot^[1]和Ace^[2]是作為霍亂弧菌的除CT以外的致瀉毒素而命名的，新的研究發(fā)現^[4]zot、ace和orfU等基因產(chǎn)物為形成CTXΦ所必需。

　　對于zot、ace和ctxAB基因的共存關(guān)系，Johnson等人^[7]對167株來(lái)自環(huán)境及病人的O1群和非O1群霍亂弧菌的檢測，發(fā)現ctxAB基因存在時(shí)必然有zot基因的存在，而沒(méi)有兩者之一單獨存在的情況；Faruque等^[8]認為自臨床病人分離的霍亂弧菌中zot并不離開(kāi)ctxAB基因而單獨存在；Colombo等^[12]對臨床和環(huán)境分離株的研究認為zot、ace和ctxAB基因是嚴格共存的；而在Karasawa等^[9]的研究中，盡管絕大多數ctxAB陽(yáng)性菌株zot基因也存在，但仍在1株臨床分離菌株和36株環(huán)境和食物分離菌株中發(fā)現ctxAB^-而zot⁺。

　　在我們的研究中，通過(guò)Southern blot分析，發(fā)現從一些ctxAB^-菌株中仍能檢測到zot、ace、cep和RS基因，這樣的4株菌均屬El Tor小川型，分離自河水中。另有一株來(lái)自病人的EVC稻葉型菌株僅有RS基因，而沒(méi)有其它4個(gè)基因。從它們存在的相互關(guān)系上，我們認為當存在ctxAB基因時(shí)，則也同時(shí)存在zot、ace、cep和RS等CTXΦ的基因，而存在CTXΦ基因的菌株，卻不一定帶有ctxAB基因，這種基因存在的非平行關(guān)系將有助于我們認識這些基因各自的來(lái)源和功能。

　　Waldor和Mekalanos^[4]以卡那霉素抗性基因作標記替換CTXΦ中的ctxAB基因，誘導產(chǎn)生了噬菌體CTXΦ，表明ctxAB是作為CTXΦ的攜帶物而存在的，在噬菌體形成中不起作用。那么我們所研究的只含zot、RS等噬菌體基因而不含ctxAB的菌株中，存在的應當是這種CTXΦ噬菌體的“原型”。一般來(lái)說(shuō)，攜帶這種CTXΦ噬菌體“原型”的菌株，應當表現出對同源噬菌體感染的免疫力，使之難以獲得ctxAB基因而轉變?yōu)楫a(chǎn)CT毒株。這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

　　菌株77013只含RS的同源序列，從DNA雜交來(lái)看至少含2個(gè)拷貝。我們另外用RS序列3'端區域設計上游引物及于5�付嗽O計下游引物，對77013染色體進(jìn)行PCR擴增（結果未列出），從擴增片段大小看，認為這2個(gè)RS序列是緊密串聯(lián)排列的。那么這個(gè)RS序列是殘存的噬菌體成分，還是一個(gè)可單獨有功能的轉座因子?對此我們將作進(jìn)一步的研究。

作者：闞飆 祁國明 劉延清 劉彩蓮 高守一

作者單位：中國預防醫學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所 衛生部醫學(xué)分子細菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室

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